禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）,属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属,可引起鸡的病毒性关节炎（Avain viral arthritis）,感染率可达100%,发病率为5%～20%,死亡率为1%～3%,能够引起肉鸡胴体品质下降和蛋鸡产蛋率下降。近年来,该病在我国流行呈上升趋势,ARV变异毒株更是给家禽业造成了严重的经济损失。竞争ELISA（Competitive ELISA,C-ELISA）是定量小分子时常用的方法。在该方法中,将与靶标功能相同的标记的竞争分子与检测样本共同孵育,随着样本中靶标分子的浓度增加,能与固相抗原结合的竞争分子呈现下降趋势,此时C-ELISA的信号降低。通过检测信号干扰量,观察预期信号输出的干扰程度来测定待测样本中抗体的浓度,能够有效避免间接ELISA潜在的二抗交叉反应,特异性强,灵敏度高。本研究采用鸡胚肝细胞分离方法对疑似感染病料进行病毒分离,通过RT-PCR检测、同源性比较、遗传进化分析等方法进行病毒的鉴定。病料研磨液接种鸡胚肝细胞后能够引起细胞融合,与典型细胞病变特征相吻合。RT-PCR检测结果与目标条带一致。通过对分离株S1～4基因的同源性和遗传变异分析发现,该分离株S1基因与经典毒株S1133、1733和2048的同源性分别只有76.4%、76.5%和76.5%,S2基因与经典毒株S1133、1733同源性能达到91.6%和91.5%,S3基因与经典毒株S1133、1733、2048同源性为88.93%、89.10%和88.22%,S4基因与经典毒株S1133、1733同源性能达到80.4%和80.5%,且均离经典毒株遗传距离较远。以上数据结果均显示本研究分离得到的是一株ARV变异毒株,将其命名为:ARV-8毒株。动物回归试验表明该毒株能够导致鸡的关节发生肿胀,关节腔有明显渗出,胸腺、脾等免疫器官肿大,且肉鸡比蛋鸡更为易感。利用本实验室构建的σC-pET-32a重组表达质粒,转入E.coli BL21（DE3）表达菌,优化诱导表达融合蛋白。通过镍柱亲和层析法进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳确定目的蛋白的表达形式为包涵体,通过蛋白质印迹（Western blot）、BCA浓度测定,证明重组蛋白表达特异性良好,反应性高。免疫14日龄的SPF鸡,每隔两周进行二免和三免,采集三免后的鸡血清,制备标准阳性血清。酶联免疫吸附试验（ELISA）测定阳性血清的效价为1:8000;通过间接免疫荧光（IFA）、Western blot、无菌性检测,证实其特异性、纯净性良好。通过方阵法确定蛋白最佳包被浓度为1:400,单抗最佳稀释浓度为1:500;血清最佳稀释浓度为1:50,羊抗鼠Ig G-HRP酶标二抗最佳稀释浓度为1:4000,封闭液选择为5%脱脂奶粉,最佳包被时间为4℃过夜,最佳封闭时间为2h,血清、单抗最佳孵育时间为1h,二抗最佳孵育时间为1h,显色液最佳时间为20min。将本研究建立的方法初步应用于临床检测,效果良好。综上所述,本研究从疑似感染的病鸡中分离鉴定出一株ARV变异野毒株,原核表达其主要结构蛋白σC,制备ARV阳性和阴性血清,建立了检测ARV抗体的竞争ELISA方法,为ARV变异毒株的检测,以及流行病学调查和疫苗评估提供了技术支持。