论文部分内容阅读
第一部分莲房原花青素对Aβ25-35所致PC12细胞损伤的保护作用目的:以Aβ25-35处理PC12细胞构建细胞损伤模型,通过LSPC的干预,观察其对Aβ25-35致细胞形态改变、损伤和凋亡情况的保护效果。方法:(1)Aβ25-35染毒时间、剂量和莲房原花青素干预剂量的确定。将细胞分为对照组和Aβ25-35不同剂量组(5、10、20及40μM),不同组别细胞分别培养0、6、12、24、48小时,采用CCK-8法在培养结束后分别检测细胞生长抑制率,确定最佳染毒时间和剂量。随后,使用不同浓度LSPC(1、2.5、5、10、20及40μg/m L)预孵育细胞,采用CCK-8法检测细胞活性,探索其保护作用及最佳干预剂量。(2)研究莲房原花青素对Aβ25-35诱导产生的细胞损伤的保护作用。细胞分为5组:对照组:正常培养;Aβ组:接种24 h后,加入20μM Aβ25-35继续培养24 h;LSPC三个细胞活性最佳的剂量组(10、20、40μg/m L):细胞接种24 h后,加入LSPC进行30 min,再加入Aβ25-35继续培养24 h。培养结束后收集细胞和培养液分别检测细胞LDH释放量、T-SOD活性及MDA含量。(3)研究莲房原花青素对Aβ25-35诱导产生的细胞凋亡的保护作用。细胞分为3组:对照组、Aβ组和10μg/m L LSPC组,干预方式同上。细胞形态学的变化通过倒置显微镜观察;使用Hoechst单染和Annexin V/PI双染后,分别使用荧光倒置显微镜和流式细胞仪观察检测细胞凋亡情况。结果:(1)与对照组细胞相比,不同浓度的Aβ25-35暴露均能够导致细胞活性的降低,呈现出一定的时间-剂量效应,细胞活性的IC50在12 h时约在40μM,24 h时约为20μM,因此选择低剂量长时间暴露的20μM、24 h作为染毒剂量和时间。LSPC的干预使细胞有不同程度的升高,在10μg/m L的剂量时,存活率最高(P<0.05)。(2)与对照组相比,Aβ25-35的暴露使细胞内T-SOD酶活性降低,而MDA含量和LDH释放量升高(P<0.05),提示Aβ25-35的暴露可能降低细胞的抗氧化能力,促进细胞膜的脂质过氧化,引起细胞膜损伤。而不同浓度LSPC的预处理能够明显改善这些损伤作用,表现为10μg/m L组降低MDA和LDH释放量的作用均好于20、40μg/m L组,而40μg/m L LSPC提高T-SOD的作用强于10、20μg/m L组,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)镜下观察发现,LSPC的预处理能够改善Aβ25-35的暴露造成的细胞数量降低,细胞形态变圆及细胞突起退化回缩等情况;Hoechst染色后在荧光显微镜下发现Aβ组凋亡的细胞数明显多于对照组,而LSPC组中细胞凋亡减少;流式检测凋亡率的结果显示,对照组细胞总凋亡率一般不超过5%,而Aβ25-35的暴露使细胞总凋亡率显著升高,达到(33.36±3.05)%,而LSPC组细胞总凋亡率显著低于Aβ组(P<0.05)。结论:在本实验研究条件下,Aβ25-35的暴露可以导致PC12细胞受损,使其形态发生改变,并促进细胞凋亡的发生,而LSPC的预孵育能够改善Aβ25-35诱导的细胞损伤。第二部分莲房原花青素对PC12细胞中CREB/BDNF表达的影响及其机制的研究目的:通过检测各组细胞中CREB/BDNF的表达情况以及其上游PI3K/AKT和Raf/ERK1/2信号通路的激活情况,探索LSPC对细胞保护作用的具体机制。方法:细胞分为:对照组、Aβ组、LSPC组(干预方式同第一部分);抑制剂组(LY-特异性AKT通路抑制剂组、PD-特异性ERK通路抑制剂组):接种后24 h换液,加入抑制剂,继续培养24 h后收集细胞;抑制剂+LSPC组:细胞24 h,换液后加入10μg/m L LSPC预处理30 min后,加入相应的抑制剂,继续培养24 h后收集细胞。细胞中BDNF蛋白表达、CREB磷酸化程度以及上游AKT和ERK1/2活化程度使用Western blot法分别检测,BDNF m RNA的表达量使用Real time PCR法检测。结果:与对照组比较,Aβ组BDNF蛋白和m RNA的表达量均有降低,其基因的调节蛋白CREB的活化程度也相应降低,其上游蛋白P-AKT和P-ERK1/2蛋白表达下调,差异有显著性(P<0.05);与Aβ组相比,LSPC的预处理显著增加了BDNF的表达,P-CREB、P-AKT和P-ERK1/2表达升高(P<0.05);相对于抑制剂组,LSPC组的预处理可以部分改善其对相应蛋白的抑制作用,差异有显著性(P<0.05),表明LSPC能够通过这两条通路调节CREB/BDNF通路。结论:1、在本实验研究条件下,Aβ25-35的暴露能够下调PC12细胞中CREB的活化,降低BDNF表达水平,LSPC的预孵育能改善上述蛋白的表达。2、抑制剂和LSPC的联合作用的结果表明,LSPC可能通过上调P-AKT和P-ERK1/2的表达,从而调节CREB/BDNF的活化,发挥其保护作用。第三部分莲房原花青素对PC12细胞中PERK/e IF2α表达的影响及其机制的研究目的:通过检测各组细胞中PERK/e IF2α的激活情况,探索LSPC对细胞内质网应激的改善,并通过CHOP/Caspase-3凋亡通路的检测和GSK-3β、Tau蛋白磷酸化程度的变化,进一步研究内质网应激对细胞的损伤及LSPC的保护机制。方法:细胞分为:对照组、Aβ组、LSPC组(干预方式同第一部分);GSK组:细胞接种后,培养24 h,换液后加入0.5 m M GSK2606414(特异性PERK抑制剂),继续培养;Aβ+GSK组:GSK2606414预孵育,30 min后加入Aβ,24 h后收集细胞。LSPC+GSK组:提前加入10μg/m L LSPC及GSK2606414预孵育30 min,加入Aβ,24 h后收集细胞。细胞中PERK/e IF2α的磷酸化程度,以及CHOP/Caspase-3凋亡通路的检测和GSK-3β、Tau的磷酸化使用Western blot法分别检测。结果:与对照组比较,Aβ组的PERK和e IF2α的磷酸化程度明显升高,该通路被活化,差异有显著性(P<0.05);与Aβ组相比,LSPC的预处理显著降低了两种蛋白磷酸化形式的表达,差异有显著性(P<0.05);加入GSK抑制剂后,该通路被抑制,而加入Aβ之后,P-PERK和P-e IF2α的表达相对于抑制剂组有所上升,表明Aβ可能部分激活了PERK/e IF2α通路的活化,引起了细胞内的ERS;而LSPC和PERK抑制剂的联用明显降低了P-PERK和P-e IF2α表达,差异有显著性(P<0.05)。此外,CHOP/Caspase-3通路以及P-GSK-3β、P-Tau蛋白的表达量与P-PERK、P-e IF2α的变化趋势一致。结论:1.在本研究实验条件下,Aβ25-35能够诱导细胞内ERS的发生,而LSPC的预孵育则可产生抑制ERS的效应。2.通过抑制ERS的发生,LSPC的预孵育能够抑制细胞凋亡通路激活,降低细胞凋亡;此外,LSPC还可通过ERS的降低抑制GSK-3β磷酸化,从而降低Tau蛋白过度磷酸化。