论文部分内容阅读
本试验以尤溪金柑（金弹Fortunella crassifolia cv. Youxijingan）等柑橘类植物试管苗为材料，进行了尤溪金柑再生体系建立与优化、柑橘类植物种质资源保存、尤溪金柑Fc-MLP2基因的克隆表达、Fc-MLP2基因转化烟草及Fc-MLP2基因功能的初步鉴定等研究。主要结果如下：1尤溪金柑再生体系建立及优化本试验优化筛选出了适合尤溪金柑试管苗增殖和生根的培养基。结果表明：KT对芽的增殖有促进作用；NAA和KT共同作用下，处理G2（MS+NAA0.05mg/L+KT1.5mg/L）的芽增殖系数显著高于其它处理；NAA和BA共同作用下，影响芽增殖的主次因素为BA> BA*NAA>NAA，芽增殖的最优培养基为：MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.05mg/L，增殖系数最高，达到了10.60；影响生根的主次因素为NAA> IBA> NAA*IBA，生根最优培养基为：MS+NAA0.3mg/L+IBA0.2mg/L，生根率最高达到了83.33%，生根数均值达到了3.27个。2尤溪金柑等柑橘类植物种质资源保存本试验以尤溪金柑为材料，研究了培养容器、培养基中的CaCl2、甘露醇和PP333等因素对柑橘种质资源缓慢生长保存的影响。结果表明：当CaCl2的浓度为0.22g/L时，尤溪金柑试管苗的根冠比最大，比较适合柑橘种质资源缓慢生长保存；在CaCl2、甘露醇和PP333共同作用下，分别在保存6个月和12个月时统计试管苗成活率，结果表明：保存6个月和12个月时处理C4(MS+CaCl20.44g/L+甘露醇0g/L+PP3331mg/L)中尤溪金柑试管苗的存活率均为最高，分别达到了100%和97.8%。本试验在原有保存3年的67份柑橘种质资源的基础上新收集了25份柑橘种质资源，并对所收集种质资源试管苗的生长状态进行观察记录。结果显示：柚类种质资源试管苗生长比较健壮，根系发达，叶片大而浓绿，但徒长严重，叶片较为稀疏；野生柑橘类试管苗长势普遍较弱，根系和茎杆都较弱，转接继代时还发现，该类试管苗生根能力也很弱；金柑类和宽皮柑橘类试管苗的长势介于柚类和野生柑橘试管苗之间。3Fc-MLP2基因的克隆与生物信息学分析本试验采用RT-PCR结合RACE技术，第一次以尤溪金柑试管苗为材料，克隆得到尤溪金柑Fc-MLP2基因的全长cDNA序列，其在GenBank中的登录号为JX310276。Fc-MLP2基因全长908bp，含有一个669bp的开放阅读框，编码223个氨基酸。生物信息学分析表明：该蛋白是定位于细胞外的一种疏水性分泌蛋白，具有2个功能位点、13个磷酸化位点和信号肽，其二级结构由α螺旋、β折叠、β转角、无规则卷曲组成。系统进化树分析表明：尤溪金柑Fc-MLP2蛋白与粗皮柠檬RlemMLP2蛋白亲缘关系较近，聚为同一类。推测Fc-MLP2蛋白可能在植物抗虫、抗病原菌、抗饥饿和延缓植物衰老方面起到一定作用。4尤溪金柑种质资源保存过程中Fc-MLP2基因的定量表达采用qRT-PCR技术，以18S rRNA基因为内参基因，对尤溪金柑试管苗不同保存阶段Fc-MLP2基因的mRNA转录表达进行研究，结果表明：Fc-MLP2基因在尤溪金柑保存过程中各时期都有表达，保存4个月时相对表达量最高；保存0个月和12个月时Fc-MLP2基因表达量很低，12个月时达到最低；保存8个月时Fc-MLP2基因的表达量与保存6个月时又有所增加，之后随着时间的延长Fc-MLP2基因相对表达量逐渐减少；尤溪金柑保存过程中Fc-MLP2基因的相对表达量与保存过程中尤溪金柑的生长状态密切相关，当尤溪金柑的生长活动较活跃、保存过程中有新叶发出时，Fc-MLP2基因的相对表达量较高。5尤溪金柑Fc-MLP2转化烟草与功能验证本试验通过XbaⅠ和SalⅠ双酶切技术构建pCAMBIA1301-Fc-MLP2表达载体，并转化到农杆菌EHA105中。农杆菌介导法将Fc-MLP2基因导入烟草，潮霉素抗性筛选后对抗性植株进行PCR检测和GUS检测。结果显示：目的基因片段已成功转入到烟草中，转化率为62.22%。低温（4℃）和机械损伤处理转基因烟草，分别在处理后的0、3、6、12、24、48h时取样进行qRT-PCR扩增，检测不同时间段Fc-MLP2基因的表达量变化。结果显示；低温处理后转基因烟草中Fc-MLP2基因相对表达量均显著减少；转基因烟草在受到机械伤害12h后，Fc-MLP2基因相对表达量显著增加。可以推测，Fc-MLP2基因可起到抵御逆境的作用。