应用具有细胞毒活性的毒素蛋白治疗肿瘤的研究始终滞留在体外实验水平。通常使用的毒素蛋白是通过DNA重组技术克隆与表达的导向毒素蛋白，即将毒素蛋白与肿瘤细胞表面受体的配体融合表达。这种导向毒素固然可在相当程度上解决毒素作用的特异性问题，但仍不能够完全将毒素蛋白限定在肿瘤细胞内。而且该种毒素蛋白经静脉注射导入体内会因其免疫原性产生抗体，并因随后发生的中和反应而很快失效。存在于自然界的上千种抗肿瘤蛋白质也由于这个原因不能得以开发，无法发应用于恶性肿瘤的治疗。本课题针对这一瓶颈，设计了两种新型靶向性基因治疗方案，探索毒素于恶性肿瘤治疗中的应用，力求避免其毒副作用的同时，也避免其免疫原性。选用毒素蛋白功能区段编码基因替代毒素蛋白，使用人源靶向性融合蛋白将毒素基因送入特定的肿瘤细胞，在胞内表达毒素蛋白杀灭肿瘤细胞。主要创新之处在于改进与发展国外近期出现的DNA／蛋白质复合物的技术路线，以DNA重组技术构建并表达一种融合蛋白作为非病毒载体，并将直接在血循环中使用毒素蛋白的方法改为将相应的毒素基因表达重组体导入特定细胞内，在该种细胞内表达出毒素蛋白，将其杀灭。这样既可以有效地应用毒素蛋白杀灭肿瘤细胞，同时又能避免其免疫原性。第一种：”单开关”设计。融合蛋白由DNA结合蛋白组蛋白H1 C末端106个氨基酸（H1s）与EGF C末端有受体结合活性而无刺激肿瘤细胞增生活性的22个氨基酸（EGFc）组成。试图通过H1s结合并包裹含有毒素编码基因的表达型重组体，在导向分子EGFc的携带下，利用EGFc与肿瘤细胞表面EGF受体相结合而引发的内吞作用，将H1s-EGFc／毒素基因表达重组体这一复合物导入肿瘤细胞内。且因毒素基因在胞内的表达而杀灭该肿瘤细胞，同时又不伤及其它细胞，并避免了毒素蛋白的免疫原性。通过PCR获得H1s和EGFc编码区段。将它们的融合序列克隆于毕赤酵母表达载体中，并通过表达盒（5’AOX启动子-H1s-EGFc-3’AOX终止子）的多拷贝插入构建含有不同拷贝数的重组子。用Sall或Bglll酶切线性化各重组子，并转化P.pastoris酵母菌株。经过G418筛选和SDS-PAGE电泳鉴定挑选表达株和高表达株。用高表达株进行大规模诱导培养，大量收集目的蛋白。SDS-PAGE凝胶激光扫描分析显示目的蛋白占上清总蛋白的60％-65％，产量约为2.5mg／L。收集的蛋白通过两步层析进行纯化——阴离子柱交换层析和分子筛。第一步纯化后蛋白纯度达到80％以上，两步纯化后蛋白纯度超过90％，可以得到纯品蛋白0.75mg／L。纯化后的蛋白冻干保存。绿脓杆菌毒素第Ⅲ功能域经突变（C端的REDLK突变为KDEL）成为PEⅢmut，以期表达后获得杀伤力更强的毒素蛋白。将PEⅢmut基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1myc（a）的CMV启动子下游，形成表达型重组体pA-PEⅢmut。细胞试验前用RPM-1640细胞培养基溶解蛋白干粉，与PEⅢmut重组体DNA的RPM-1640溶液等体积混合制备蛋白／DNA复合物，DNA／蛋白质量比为1／1.2。选用EGFR高表达的宫颈癌细胞株Hela、神经胶质瘤细胞株BT325、胎肺成纤维细胞2BS（正常细胞）和EGFR不表达的Jurkat淋巴瘤细胞株为对缘进行上述蛋白／DNA复合物靶向杀伤试验。存活细胞计数和T检验分析显示蛋白／DNA复合物对高表达EGFR的Hela细胞、BT325细胞和2BS细胞均有显著的杀伤作用，并有一定的剂量依赖性；而对Jurkat细胞无杀伤作用。作为对照，单独使用H1s-EGFc和pA-PEⅢ对4种细胞均无杀伤作用。当复合物剂量为1 ug／ml、2 ug／ml、3ug／ml时，对BT325细胞的杀伤率分别为：62.81％、61.73％和62.81％。复合物剂量为3 ug／ml、6 ug／ml、9 ug／ml时，对Hela细胞的杀伤率分别为35.4％，55.8％及62.9％；对2BS细胞的杀伤率分别为6.86％，32.46％及45.24％。上述结果表明H1s-EGFc／pA-PEⅢ复合物可以有效的靶向性杀伤EGFR高表达的瘤细胞，具有一定的细胞特异性；但是对高表达EGFR的正常细胞也有杀伤作用。此复合物虽然可以避免毒素蛋白的免疫原性问题，但靶向设计不够准确，仍然有不可忽视的杀伤正常细胞的毒副作用，因此必须进一步加以改进。第二种：“双开关”设计。本课题设计的第二种融合蛋白以在许多恶性肿瘤细胞表面过量表达的胃泌素释放肽受体（GRP-R）为靶点，选用其高亲和性配体胃泌激素GRP作为导向分子。选取酪氨酸磷酸酶（PTP）与C-myc蛋白上具有DNA结合作用的氨基酸区域作为融合蛋白的DNA结合区用以结合与包裹PEⅢmut DNA重组体。通过PCR获得大肠杆菌嗜好性GRP、PTPc和C-mycδ编码区段，构建PTPc-PTPc-GRP（P₂G）与PTPc-PTPc-C-mycδ-GRP（P₂CG）融合序列，分别插入多种大肠杆菌表达载体上。诱导培养和SDS-PAGE电泳鉴定显示，重组子pET28a-P2G和pET28a-P2CG有较高水平的表达，表达蛋白均以包涵体形式存在。切胶纯化两种目的蛋白以作为非病毒载体。为了将毒素基因的表达严格控制在肿瘤细胞中，从人基因组DNA中PCR扩增得到组织特异性启动子——癌胚抗原CEA的启动子，构建真核表达重组子pGL3-Pcea-PEⅢmut。将该重组子pGL3CEA-PEⅢmut及作为对照的非特异启动子SV40调控的重组子pGL3-SV40-PEⅢmut，分别与两种融合蛋白P₂G和P₂CG结合制备DNA-蛋白质复合物。蛋白和DNA的质量比分别是：DNA／P2G为1／3，DNA／P2CG为1／4。选用GRPR和CEA同时高表达的胃癌细胞株MKN45和用作对照的两者均不表达的2BS细胞株进行细胞杀伤试验。用DNA／蛋白复合物、单独pGL3-Pcea-PEⅢmutDNA重组体、单独pGL3-SV40-PEⅢmutDNA重组体、单独P2G蛋白和单独P2CG蛋白分别转染两株细胞。MTT法检测活细胞数、T检验分析杀伤作用。结果显示，DNA-蛋白质复合物：P₂G／pGL3-Pcea-PEⅢmut与P₂CG／pGL3-Pcea-PEⅢmut在高剂量时对MKN-45细胞有显著的杀伤作用，存在剂量依赖性，剂量为0.5ug／ml无明显杀伤；对2BS细胞无明显杀伤作用。以SV40为启动子的复合物作用相同且杀伤率更高。当复合物使用剂量为1ug／ml和4ug／ml时，Pcea／P2G复合物对MKN45的杀伤率是：20.2％和29.8％；Pcea／P2CG对MKN45的杀伤率为：14.1％和26.2％。SV40／P2G对MKN45的杀伤率分别是28.4％和50.5％；SV40／P2CG为27.1％和45.3％。P2G复合物与P2CG复合物杀伤率之间无显著性差异。由于表达的两种蛋白在N端融合有34个氨基酸的载体序列，可能在人体内引发抗外源蛋白的免疫反应，减弱或消除复合物的功效。因此本研究通过PCR在P2G编码序列上游引入凝血酶识别位点并融合于硫氧还蛋白（TrxA）下游，在pET30a载体上构建了TrxA-Th-P2G-pET28a重组子获得了融合表达。目的蛋白占菌体总蛋白16.3-18％，产量约为56.5mg／L。大量收集TrxA-P2G融合蛋白，通过SP sepherose阳离子柱交换层析-凝血酶切割-Resouce S阳离子柱交换层析-反相柱可以获得较纯的P2G蛋白。为了增强CEA启动子的活性在pGL3-Pcea-PEⅢmut重组子的PEⅢmut与Pcea之间加入具有增强子功能的兔珠蛋白Intronll，构建了重组子DYPⅡ。制备P2G／Lipofectamin／pGL3-Pcea-PEⅢmut、P2G／Lipofectamin／DYPⅡ和P2G／Lipofectamin／pGL3三种复合物，DNA／Lipofectamin／P2G质量比为1：0.5：5。选取GRPR和CEA均高表达的MNK45和乳腺癌细胞MCF-7；GRPR表达CEA不表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231；GRPR不表达CEA表达的肺癌细胞A549；GRPR与CEA均不表达的Hela细胞进行细胞杀伤试验。MTT法计数活细胞、T检验分析显示单独DNA和单独Lipofectamin／P2G混合物转染各组均无杀伤、P2G／Lipofectamin／pGL3复合物对各细胞均无杀伤。复合物P2G／Lipofectamin／pGL3-Pcea-PEⅢmut和P2G／Lipofectamin／DYPⅡ对MKN45、MCF-7均有显著杀伤，存在剂量依赖性。剂量分别是2ug／ml、4ug／ml和8ug／ml时，两种复合物对MKN45的杀伤率分别是27.9％、39.4％、48.4％和30.4％、38％、44.4％；对MCF-7的杀伤率是21.1％、35.8％、44.1％和23.5％、34.9％、43.7％。T检验结果显示：Intronll的加入并未提高复合物的杀伤效果。显然这一双开关设计中，GRP导向的DNA／蛋白质复合物，对富含GRP受体的肿瘤细胞有良好的靶向作用，使毒素基因PEⅢmut表达型重组体不能被导入GRP-R^-和CEA⁺以及GRP-R^-和CEA^-的非肿瘤细胞中。而在GRP-R⁺和CEA^-的正常细胞中，又因PEⅢmut基因无法被启动，以致没有毒素蛋白的表达，细胞将不会被杀伤。毒素基因只能在GRP-R⁺和CEA⁺的肿瘤细胞内表达出PEⅢmut毒素蛋白、杀灭该种肿瘤细胞。因此实现了准确的靶向杀伤作用。这一设计，引导出了“个体化诊断与个体化治疗”的必要性，因此这一复合物的适应症只能是GRP⁺+CEA⁺的胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌及结肠癌等。本研究探索了以“个体化诊断、个体化治疗”为主要特征的21世纪新医学的一个点的情况，但当然是十分初步的探索。国际上在恶性肿瘤靶向基因治疗的研究中，这种“双开关”的设计刚刚起步，使用的功能基因是报告基因。本研究使用了毒素基因，进入了实质性的研究。本研究在非病毒载体的设计及其工程化研制，GRP-R⁺和CEA⁺双开关设计，以CEA启动子启动功能基因PEⅢmut，以及DNA／蛋白质复合物的组合等设计方面为国内外首次尝试，具有创新性。