论文部分内容阅读
前言类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种主要累及周围关节为主的自身免疫性疾病。现知RA由多种因素引发,T细胞在RA的发病和进展中起关键性作用,近年的研究发现,类风湿性关节炎与机体的免疫功能紊乱密切相关,多种复杂的细胞因子参与了类风湿性关节炎患者关节的破坏和全身紊乱过程。TNF-α和IL-1的抑制物干扰性治疗在RA中取得了良好的疗效,这充分支持了细胞因子在RA中发挥着重要作用的观点。IL-17是由新近被证实的一类不同于Th1和Th2细胞亚群的CD4+辅助性T细胞亚型—Th17细胞（此亚群细胞可产生IL-17、IL-6和TNF-α而不产生IFN-γ和IL-4）产生的促炎性细胞因子,表达在T细胞上,其受体（IL-17R）表达在大多数细胞和组织上。IL-17是一个促炎症反应的调节因子,对靶细胞可以产生炎症诱导作用。IL-17在调节免疫和炎症应答,调节一些组织内环境的稳定和自身免疫疾病的进展中发挥重要作用。IL-17作为T细胞诱导炎症的一个重要的活化剂,与TNF-α和IL-1β又有一些共同的生物学特性,IL-17可以抑制RA滑膜和骨Ⅰ型胶原的合成,刺激它的分解,因此在RA发病机理中可能起到作用。目前对IL-17在RA发病机制中发挥作用的研究仍不是很完善。最新的研究显示,在正常人的外周血和患者的炎症组织中,记忆/效应性Th17细胞出现在CCR6+亚群当中,CCR6+CCR4+T细胞可以特异性产生大量的IL-17,而不产生IFN-γ,同时这些细胞还表达对Th17发育起关键作用的转录因子…孤独受体（RORrt）。目前CCR4和CCR6是否可以作为Th17细胞表面的特征性标志,还有待进一步研究。本实验拟研究中国RA活动期患者、RA稳定期患者、系统性红斑狼疮患者和健康人血清中IFN-γ、IL-10、IL-17水平的差异,及外周血CD4+T细胞表面CCR4和CCR6表达水平的差异,以明确IL-17、CCR4、CCR6与RA疾病的相关性以及IL-17与CCR4和CCR6的相关性,探讨Th17细胞在RA中的作用地位,为寻找以细胞因子为靶点应用于RA临床治疗的新策略提供科学依据。实验材料1、研究对象选择本院门诊及住院RA患者65例,入选标准:符合1987年美国风湿病协会修订的RA诊断标准,并排除有严重心脑血管、肝肾疾病和其他自身免疫性疾病,年龄18-60岁,平均41±13岁,其中男20例,女45例,活动期35例,稳定期30例作为病例组,判断活动期的标准为满足以下5项指标中的3项或3项以上者,包括:①3个或3个以上关节肿;②每日＞45min的晨僵;③血沉≥28mm/h;④3个或3个以上关节压痛;⑤双手平均握力（每只手各测3次,将单手最高值相加除以2为所得值）,男性≤192mmHg,女性≤146mmHg;系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）患者35例,入选标准:符合1997年美国风湿病协会修订的SLE诊断标准,并排除有严重心脑血管、肝肾疾病和其他自身免疫性疾病,年龄18-60岁,平均39±13岁,其中男10例,女25例作为病例对照组;健康对照组为本院健康体检者50例,年龄18-60岁,平均38±12岁,其中男17例,女33例,血液系统及肝肾功能检查正常,乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性,无免疫系统疾病史。SLE组和健康组的年龄、性别与RA组均相匹配。2、实验仪器及试剂购自BECTON DICKINSON公司的主要实验设备及试剂,包括流式细胞仪（FACS-Aria）;10mlEDTA抗凝管;单克隆抗体:CD3-PerCP、CD4-FITC、CCR6-PE、CCR4-PE-Cy7。IFN-γ、IL-10、IL-17的ELISA定量试剂盒购自R&D公司。其余试剂自行配制:溶血素（KHCO3:1.0g,NH4CL:8.25g,EDTA·Na2::0.037g,Water:1000ml）。实验方法1、血清IFN-γ、IL-10、IL-17水平检测采集血清标本,使用R&D公司定量试剂盒（ELISA法）对血清IFN-γ、IL-10、IL-17水平进行检测,酶标仪检测450nm处读OD值,以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线,计算IFN-γ、IL-10、IL-17含量。2、外周血CD4+T细胞表面CCR4和CCR6表达水平的检测应用以下PerCP、FITC、PE、PE-Cy7标记单抗组合对RA患者、SLE患者和健康对照组全血进行分析:CD3/CD4/CCR6/CCR4;另设1管对照。加入100μl抗凝血,按上述组合依次加入单抗,室温避光30min。加入溶血素3ml,室温,1200r/min离心5min,弃上清,洗涤两次。加入1%多聚甲醛的PBS 200μl悬浮,BD FACDiVaTM软件进行检测分析。3、流式细胞仪分析及统计学分析使用前向散射角（FSC）及侧向散射角（SSC）确定淋巴细胞群,以CD3+T淋巴细胞为门,再分别以CD4+T淋巴细胞为门,分析CCR4和CCR6的表达水平。选用SPSS13.0统计学分析软件。RA活动期患者、RA稳定期患者、SLE患者组和健康对照组血清IFN-γ、IL-10、IL-17的水平及CCR4和CCR6的表达水平主要应用单向方差分析进行比较,IL-17与CCR4和CCR6的相关性采用Spearman秩相关检验,P＜0.05视为具有统计学意义。实验结果1、RA患者、SLE患者和健康对照组血清中IFN-γ、IL-10、IL-17的表达水平（1）血清中IFN-γ的表达水平与健康对照组相比,RA活动期和稳定期患者血清中IFN-γ的表达水平均出现有意义的升高（P＜0.05）;SLE患者血清中的IFN-γ水平也明显高于健康对照组（P＜0.05）;RA活动期和稳定期与SLE组相比,差异均无统计学意义（P＞0.05）;RA活动期与稳定期相比,无显著差异（P＞0.05）。（2）血清中IL-10的表达水平与健康对照组相比,RA活动期和稳定期患者血清中IL-10的表达水平都稍有升高,但差异均无统计学意义（P＞0.05）;SLE患者的IL-10水平显著高于健康对照组（P＜0.05）;RA活动期和稳定期与SLE组相比,差异均具有显著性（P＜0.05）;RA活动期与稳定期相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）血清中IL-17的表达水平RA活动期患者血清中IL-17的表达水平与SLE患者和健康组相比,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;而RA稳定期患者与SLE患者和健康组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）;SLE患者IL-17的表达水平与健康组相比,差异无统计学意义（P＜0.05）;RA活动期与稳定期患者相比,差异显著（P＜0.05）。2、RA患者、SLE患者和健康对照组外周血CD4+T细胞表面CCR4和CCR6的表达（1）外周血CD4+T细胞表面CCR4的表达RA活动期患者外周血CD4+T细胞表面CCR4的表达水平与健康组相比,差异具有显著的统计学意义（P＜0.01）,而与SLE组相比,无显著性差异（P＞0.05）;RA稳定期患者与SLE患者和健康组相比,差异均无统计学意义（P＞0.05）;SLE患者与健康组相比,CCR4的表达水平升高明显（P＜0.05）;RA活动期与稳定期相比,差异显著（P＜0.05）。（2）外周血CD4+T细胞表面CCR6的表达RA活动期患者外周血CD4+T细胞表面CCR6的表达水平与SLE患者和健康组相比,差异均有明显的统计学意义（P＜0.01）;RA稳定期与健康组相比,差异显著（P＜0.05）,而与SLE组相比,无明显差异（P＞0.05）;SLE患者与健康组相比,CCR6的表达水平无明显变化（P＞0.05）;RA活动期与稳定期相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（3）外周血CD4+T细胞表面CCR4+CCR6+T细胞的表达RA活动期患者外周血CD4+T细胞表面CCR4+CCR6+T的表达水平与SLE组和健康组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）;RA稳定期与SLE组和健康组相比,无显著性差异（P＞0.05）;SLE患者CCR4+CCR6+T的表达水平与健康组相比,差异无显著性（P＞0.05）;RA活动期与稳定期相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。3、RA患者外周血中IL-17与CCR4和CCR6的相关性比较RA活动期和稳定期患者血清中IL-17的水平与外周血CD4+T细胞CCR4表达的相关性比较,结果无明显的相关性（P＞0.05）,但与CCR6的表达和CD4+CCR4+CCR6+T的数量呈正相关（P＜0.05）。结论1、RA活动期和稳定期患者血清中IFN-γ的水平均出现有意义的升高,但IL-10的分泌水平没有显著变化。提示Th1细胞应答增强抑制了Th2反应,进而使Th1/Th2失衡,导致了成人RA的发生。2、RA活动期患者血清中IL-17的水平明显高于SLE患者组和健康对照组。由此证实了RA的发生和发展与Th17细胞的参与有关。3、RA活动期患者外周血中趋化因子受体CCR4和CCR6的高表达,可能与Th17细胞介导RA的发生存在密切的联系。