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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是 1987年首次在美国被确认,主要特征是仔猪发生呼吸道症状,母猪发生繁殖障碍,包括流产、产死胎和木乃伊胎。PRRS给养猪业造成了巨大的经济损失,被认为是世界上最重要的猪传染性疾病之一。该病病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。根据抗原性差异,目前有两种公认的PRRSV基因型:以Lelystad virus(LV株)为代表的欧洲型和以ATCC VR-2332(VR株)毒株为代表的美洲型。我国于1996年由郭宝清等首次在爆发流产的胎儿中分离到PRRSV,2006年我国南方猪群爆发高致病性毒株(HP-PRRSV)。目前,我国防控PRRSV的主要措施仍是接种改良弱毒疫苗(MLV),疫苗的种类主要有JXA1-R、TJM-F92、Ingelvac。临床上,由于PRRSV高致病性株、经典株及疫苗株普遍存在,给病原学检测和诊断带来很大的困难。目前PRRSV检测方法主要有病原学、血清学和分子生物学诊断技术。其中病原学方法耗时费力;血清学方法特异性较低,容易出现交叉反应:分子生物学诊断技术敏感性和特异性较强,但不能同时检测和区分多种PRRSV毒株。因此,本研究主要是建立一种快速灵敏、可同时检测并区分我国5种常见PRRSV毒株的方法,并且成功地应用于我国养殖场、屠宰场PRRSV的检测。一步反转录FRET-qPCR检测和区分PRRSV高致病性毒株、经典株和疫苗株方法的建立本研究主要是基于Nsp2基因,设计特异性引物和探针,建立一种一步反转录FRET-qPCR检测和区分PRRSV高致病性株、经典株和疫苗株的方法(PCR产物197 bp)。应用本研究建立的方法对PRRSV病毒株制备的标准品进行检测,表明其灵敏度达到单拷贝/反应体系。此外,本试验选择高致病性株(HP-BB)和疫苗株(JXA1-R),稀释成不同浓度与SPF猪的血液样品混合,进行Spiking试验验证该方法灵敏度,结果表明,本研究所建立的一步反转录FRET-qPCR方法具有高灵敏度。通过对5种PRRSV毒株的熔解曲线进行分析发现PRRSV毒之间Tm值存在差异,具体可以分为5组,说明该方法具有高特异性。综上所述,本研究建立的方法具有高灵敏度、高特异性可同时检测和区分出我国5种常见PRRSV高致病性株、经典株和疫苗株。一步反转录FRET-qPCR检测和区分PRRSV高致病性毒株、经典株和疫苗株方法的应用应用本研究所建立的一步反转录FRET-qPCR方法进行PRRSV的检测和鉴定,研究表明,来自中国10个省的健康猪群的血液样品、肺、眼结膜、鼻腔及粪便拭子中PRRSV的总阳性率为3.3%(28/846),在5个省份7个地区的临床样品中检测到阳性PRRSV,其中肺的阳性最高。疫苗株和高致病性株阳性率高,且同时存在疫苗株与野毒株混合感染。综上所述,本研究建立了基于Nsp2基因,建立了快速、灵敏、特异的一步反转录FRET-qPCR方法,每个PCR系统可以检测到单拷贝的Nsp2基因,可以在单一的PCR系统中检测该5种PRRSV毒株,通过溶解曲线中Tm值的差异区分5种PRRSV,分为5组。应用该方法对我国10个省份地区的养殖场健康猪群的临床样品进行检测的结果表明,疫苗株和高致病性株阳性率高,且同时存在疫苗株与野毒株混合感染,为临床PRRS的监测和防控提供重要参考和技术支撑。