基于PI3K/AKT/FOXO3A通路大戟大枣汤抗乳腺癌作用及其机制研究

来源 :黑龙江中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:huangshjing
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目的:  中医历来认为“邪毒”结于体内为肿瘤根本;中医在治疗恶性肿瘤时,常在辩证的基础上,用“以毒攻毒”法辨病治疗;中药狼毒大戟为大戟科植物,文献报道其药理活性多样,但亦有较大的毒副作用;故用其抗肿瘤时,既要用其毒也要减其毒;依照仲景名方“十枣汤”提示,使用大戟类药材时可配伍大枣来缓和其峻下逐水、胃肠不适等毒副作用。基于此,本研究拟采用大戟大枣汤作为实验药物,研究其对人乳腺癌MCF-7细胞及其裸鼠移植瘤的凋亡作用并探讨其分子机制。  方法:  ①制备大戟大枣汤含药血清;体外培养人乳腺癌MCF-7细胞。通过CCK-8法及高内涵细胞成像系统分析含药血清联合LY294002(PI3k抑制剂)对MCF-7细胞增殖及凋亡作用的影响;应用光学显微镜、荧光显微镜及电镜观察含药血清对MCF-7细胞形态学变化的影响;应用激光共聚焦显微镜观察JC-I染色后含药血清对MCF-7细胞线粒体膜电位变化的影响;应用RT-PCR法检测含药血清对MCF-7细胞内Bcl-2、Bax、Bim基因mRNA表达的变化;应用免疫荧光法、流式细胞术检测含药血清对MCF-7细胞内Bcl-2、Bax、Bim、PI3k110、p-Akt473、p-FoxO3a253蛋白表达的变化;应用流式细胞术及Western Blot检测含药血清联合LY294002对MCF-7细胞PI3k/Akt/FoxO3a信号通路p-Akt473、p-FoxO3a253蛋白表达的影响。  ②建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型,给予大戟大枣汤治疗4w,测定药物对乳腺癌移植瘤生长的影响;应用光学显微镜、荧光显微镜及电镜观察移植瘤组织的细胞形态学变化;应用TUNEL染色法及流式细胞仪检测药物治疗的移植瘤组织的细胞凋亡情况;qrt-PCR法检测移植瘤组织的细胞中Bcl-2、Bax、Bim基因mRNA表达的变化;Western Blot、免疫荧光法检测移植瘤组织的细胞中Bcl-2、Bax、Bim、PI3k110、p-Akt473、p-FoxO3a253蛋白表达的变化。  结果:  ①CCK-8检测结果显示:与对照组比较,大戟大枣汤含药血清可明显抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,并呈现时间和剂量依赖性,且加入LY294002后抑制效果更明显;高内涵分析结果显示:与对照组比较,含药血清可剂量依赖性的诱导MCF-7细胞凋亡,且加入LY294002后诱导凋亡的效果更明显;光学显微镜、荧光显微镜及电镜结果显示:与对照组比较,各药物组MCF-7细胞有一定的凋亡形态改变;激光共聚焦显微镜结果显示:与对照组比较,JC-I染色后各药物组细胞线粒体膜电位降低;RT-PCR检测结果显示:与对照组比较,各药物组可上调细胞内Bax、Bim基因的表达并下调Bcl-2基因的表达;免疫荧光法及流式细胞术检测结果显示:与对照组比较,各药物组可上调细胞内Bax、Bim蛋白的表达并下调Bcl-2、PI3k110、p-Akt473、p-FoxO3a253蛋白的表达。流式细胞术及Western Blot检测结果显示:与LY294002联合作用或含药血清单独作用均能下调p-Akt473、p-FoxO3a253蛋白的表达。  ②大戟大枣汤对裸鼠皮下肿瘤生长的影响:与模型组比较,大戟大枣汤及紫杉醇均能够抑制乳腺癌移植瘤的生长,表现为随药物剂量增加抑制作用增强;抑瘤率结果显示:经治疗后的各药物组抑瘤率,随给药剂量的增加而增大。光学显微镜、荧光显微镜及电镜下观察显示:与模型组比较,移植瘤组织经治疗后,细胞凋亡形态学变化显著。TUNEL染色及流式分析结果表明:与模型组比较,药物治疗的移植瘤组织中细胞凋亡程度增加;qrt-PCR结果显示:与模型组比较,各药物组均可明显的上调移植瘤组织的细胞中Bax、Bim基因表达并下调Bcl-2基因的表达;Western Blot、免疫荧光法检测结果显示:与模型组比较,各药物组均可明显的上调移植瘤组织细胞中Bax、Bim蛋白的表达并下调Bcl-2、PI3k110、p-Akt473、p-FoxO3a253蛋白的表达。  结论:  大戟大枣汤可通过调节Bcl-2家族及PI3k/Akt/FoxO3a信号通路相关因子的表达而起到体内外抗乳腺肿瘤的作用。
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