毛乳头细胞（dermal papilla cells,DPCs）是位于毛囊底部的特殊的成纤维细胞团,绒山羊绒毛生长和周期性发育机制与毛乳头细胞的增殖密切相关,这一过程受到多个基因的调控。研究表明Hoxc13基因在控制毛发形成中具有重要作用,其主要在真皮乳头细胞中表达,经过该基因过表达或者缺陷处理的小鼠都显示异常的毛发生长。目前利用转录组等多种方法鉴定了大量与绒山羊绒毛生长和周期性发育相关的候选基因,但所筛选的基因数目庞大,且差异较大,这为从中选择少数关键基因而进行后续的功能研究带来了不便。因此,需要在筛选方法上进行创新。基于CRISPR的筛选系统可实现多靶点的基因组编辑,同时在基因功能的鉴定方面被大规模的应用,包括对细胞耐药性、细胞增殖等相关基因的筛选。因此,本研究利用CRISPR聚焦型文库,通过在陕北白绒山羊DPCs中实现基因敲除,进而鉴定DPCs增殖的必需基因（essential genes）。试验过程及具体结果如下:（1）设计并构建CRISPR聚焦型文库。选择本实验室前期所鉴定的以及NCBI上已公布的绒山羊皮肤和毛囊差异表达基因,共822个基因用于文库的构建。该文库包含4910条sg RNA,其中40条为非靶向山羊基因组的阴性对照sg RNA,另外4870条sg RNA分别靶向822个蛋白编码基因。通过高通量测序技术对文库质量进行评估,发现文库中85%的sg RNA具有最佳的GC含量;97.85%的sg RNA靶向所有Ref Seq同工型共有的外显子;86%的sg RNA靶向基因内mRNA的5’端。以上结果表明CRISPR聚焦型文库具有高度的编辑活性,可用于高质量筛选。（2）毛乳头细胞的鉴定。显微镜下观察细胞,可见该细胞具有凝集性生长特性、呈扁平状和多角形等特征;对细胞进行免疫荧光染色,发现α-SMA和Vimentin毛乳头细胞分子标记物免疫荧光呈阳性表达,表明该细胞为DPCs。（3）毛乳头细胞增殖必需基因的筛选。在MOI值为0.5的条件下对DPCs进行慢病毒文库感染,48 h后使用嘌呤霉素进行筛选,而后转入正常的细胞培养,分别在药筛后第0天（D0）、第9天（D9）和第15天（D15）收集存活的细胞用于高通量测序。利用高通量测序及生物信息学技术筛选DPCs增殖的必需基因,最终共获得57个候选基因。结合GO分析和KEGG通路分析发现这些候选基因与细胞生长、细胞周期和细胞凋亡有关。（4）必需基因的功能验证。在排名前10的候选基因中选择SBDS、HJURP以及FNDC5进行功能验证。利用siRNA干扰SBDS、HJURP以及FNDC5基因在DPCs中的表达,通过CCK8增殖试验、Ed U和流式细胞仪检测细胞周期技术等检测其对DPCs增殖的影响。结果表明干扰SBDS基因和HJURP基因的表达抑制了DPCs的增殖;干扰FNDC5基因的表达促进了DPCs的增殖。本试验以陕北白绒山羊背部皮肤为原材料分离纯化DPCs,根据实验室前期以及NCBI上已公布的与皮肤毛囊生长有关的差异基因构建CRISPR聚焦型敲除文库,利用慢病毒将CRISPR文库导入DPCs,进而实现基因敲除,随后基于阴性筛选策略利用高通量测序技术以及生物信息学技术筛选并鉴定DPCs增殖过程中的必需基因。本论文为进一步挖掘和鉴定在绒山羊中具有重要研究和育种价值的关键基因提供了新的研究方法,同时为动物功能基因组学研究提供了参考。