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[目的]构建牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)GroEL的大肠杆菌表达体系,并探究诱导大肠杆菌表达GroEL的最佳Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)浓度及 IPTG 浓度影响 GroEL 表达量的可能原因,以获取充足的GroEL用于P.gingivalis相关动脉粥样硬化的疫苗研究。[方法]构建GroEL的大肠杆菌表达体系并进行基因测序及琼脂糖凝胶电泳以验证质粒构建的正确性;运用不同浓度IPTG(0,10,20,30,50,100,200,1000 μM)诱导构建的大肠杆菌表达GroEL,超声破碎IPTG诱导后的大肠杆菌并高速离心分别收集上清和沉淀,运用蛋白质印记法验证GroEL的表达;运用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯亮蓝染色及胶体分析软件定量分析并比较上清和沉淀内GroEL的表达量。IPTG在诱导蛋白表达的同时,亦存在一定的抑制效应,利用透射电镜及生长曲线测定分别观察不同IPTG浓度下包涵体的形成及大肠杆菌的生长情况,验证IPTG对GroEL表达量的负向影响作用。[结果]基因测序及琼脂糖凝胶电泳结果表明,用于GroEL表达的质粒构建成功;蛋白质印记法结果表明合成蛋白即为GroEL。IPTG诱导大肠杆菌4小时,随后进行超声破菌,离心后的上清及沉淀中均存在GroEL,但该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在上清中,沉淀中的包涵体(inclusionbody,IB)内 GroEL含量相对较少。IPTG的加入可明显增加上清中GroEL的表达量,当IPTG浓度低于30 μM时,蛋白表达量随着IPTG浓度增加升高;当IPTG浓度达到30μM及以上时,蛋白量不再随IPTG的浓度变化而变化。IPTG在诱导蛋白表达的过程中,存在诱导包涵体形成及抑制大肠杆菌增殖的负向作用。TEM检测结果表明,IB的形成有随IPTG浓度增加而增多的趋势。当IPTG浓度达到200 μM时,IB几乎占据了 GroEL-E.coli胞质绝大部分空间,细胞核被压缩在一个较小的区域。根据IPTG与大肠杆菌共培养绘制的生长曲线可知,IPTG的加入明显抑制了大肠杆菌生长,且该抑制作用随着IPTG浓度的增加而增强;比较不用IPTG浓度下大肠杆菌生长平台期OD值,结果发现IPTG浓度越高,平台期OD值越低。[结论]以大肠杆菌为表达载体的蛋白表达系统可用于实现GroEL的合成;IPTG不仅具有诱导GroEL表达的作用,同时通过诱导IB形成及抑制大肠杆菌增殖影响GroEL产量;IPTG在诱导蛋白表达过程中的双向作用同时存在,且两者之间的平衡实现了最佳诱导浓度30 获得。