【摘 要】
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大多数病原是通过消化道、泌尿生殖道等黏膜途径入侵机体的。黏膜免疫系统在抵抗外界病原感染方面起着重要作用。黏膜分泌物中的SIg A、Ig M与IgG分别是由多聚免疫球蛋白受体（pIgR）与新生儿Fc受体（FcRn）介导转运获得的。FcRn也可以转运抗原抗体复合物,在保护机体防止病原入侵方面起关键作用。而当病原经黏膜入侵时,黏膜上皮FcRn的表达变化会影响宿主的抗感染能力。猪流行性腹泻病毒（PEDV）
【基金项目】
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国家自然科学项目（31572500,32072845）；
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大多数病原是通过消化道、泌尿生殖道等黏膜途径入侵机体的。黏膜免疫系统在抵抗外界病原感染方面起着重要作用。黏膜分泌物中的SIg A、Ig M与IgG分别是由多聚免疫球蛋白受体（pIgR）与新生儿Fc受体（FcRn）介导转运获得的。FcRn也可以转运抗原抗体复合物,在保护机体防止病原入侵方面起关键作用。而当病原经黏膜入侵时,黏膜上皮FcRn的表达变化会影响宿主的抗感染能力。猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪δ冠状病毒（PDCoV）与传染性胃肠炎病毒（TGEV）对各年龄段的猪均有感染性,且对哺乳仔猪感染性最强,在全国乃至世界范围内周期性流行,给我国乃至全球养猪产业都带来了巨大的挑战。本研究分离鉴定PEDV和PDCoV（同属冠状病毒）各1株,完成了全基因组测序,通过动物感染试验探究其对FcRn表达的调控机制。前期研究发现TGEV感染IPEC-J2细胞能够上调FcRn的表达,进一步探究TGEV编码蛋白及其分泌的炎性因子调控FcRn表达的具体分子机制,取得的主要研究结果如下:1.PEDV的分离鉴定及其对宿主天然免疫反应的影响将PEDV样品处理后接种Vero细胞进行培养,通过细胞病变、免疫荧光、Western blot与透射电镜观察等证实所分离病毒为PEDV,命名为JS-A株。通过对JS-A分离株的全基因组测序,并对其进行进化树分析,显示PEDV JS-A属于G2a群,与许多国家的PEDV流行株密切相关,但是与当前许多疫苗株不同。动物试验表明,攻毒组仔猪出现典型的临床症状,小肠肠壁变薄而透明,肠绒毛变短,萎缩严重并伴有脱落。此外发现,攻毒组仔猪早期空肠黏膜中TLR/RIG-I及其下游接头分子与NF-κB转录因子等表达下调,同时FcRn表达也下调,而在感染后期这些基因表达却均上调。2.PDCoV的分离鉴定及其对仔猪肠道黏膜中免疫球蛋白转运受体表达的影响将PDCoV阳性样品处理后接种LLC-PK1细胞进行培养,通过细胞病变、免疫荧光、Western blot和透射电镜观察等证实所分离病毒为PDCoV,命名为CHN-JS-2017株。将这株病毒进行全基因组测序后比对分析,发现CHN-JS-2017株与其他PDCoV株的核苷酸序列有较高的同源性（97.4%-99.6%）。动物试验表明,攻毒组仔猪出现呕吐、水样腹泻等临床症状,小肠肠壁变薄,肠绒毛部分萎缩脱落。该毒株能显著下调仔猪肠道黏膜中FcRn、pIgR和NF-κB基因的表达,且三者中两两之间呈正相关,这些结果可能有助于解释PDCoV感染的致病机制。3.TGEV编码蛋白调控FcRn表达的研究TGEV（活病毒）与UV-TGEV（紫外灭活病毒）均能上调FcRn的表达,但灭活病毒的调控作用低于活病毒,推测病毒编码蛋白也参与了FcRn的调控。为了探究参与调控FcRn表达的病毒编码蛋白,构建了病毒编码蛋白的重组质粒。将构建的质粒分别与相应的荧光素酶报告质粒共转染,结果发现TGEV核衣壳（N）蛋白可以通过NF-κB通路来增强FcRn的启动子活性。采用干扰分子试验探究TLRs是否参与TGEV调控FcRn的表达,通过RT-qPCR和Western blot方法检测发现转染si TLR3、si TLR9、si My D88、si TRIF以及si RIG-I后能够明显下调TGEV诱导的FcRn表达,结果表明TGEV可以通过TLR3/TLR9-My D88/TRIF和RIG-I通路上调FcRn的表达。4.TGEV感染细胞分泌的炎性因子调控FcRn表达的研究TGEV感染IPEC-J2细胞后,通过RT-qPCR与猪细胞因子芯片检测发现TGEV能显著上调IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α、TGF-β1的表达,提示TGEV感染可以激活IPEC-J2的天然免疫反应。TGF-β1呈剂量与时间依赖性地上调FcRn的表达,且JNK抑制剂（SP600125）处理细胞后显著减少TGF-β1诱导FcRn与c-JUN/JUN的表达,表明TGF-β1通过JNK/c-JUN通路调控FcRn表达。通过软件预测猪FcRn启动子区域存在c-JUN结合位点,并构建了一系列FcRn启动子截短体的报告质粒,转染细胞经检测发现猪FcRn基因启动子-1215～-140区域存在c-JUN结合位点,且该区域有3个c-JUN结合位点。运用体外Transwell胞转模型研究发现TGF-β1能够促进IgG的双向转运。
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