脑卒中是严重危害人类健康的常见疾病，具有高发病率、高死亡率及高致残率的特点。缺血性卒中是脑卒中的主要类型，约占所有卒中的75％[1]。神经元对缺血损伤高度敏感，致使卒中患者不可避免地发生神经元死亡。其神经元死亡导致的神经功能缺损，至今仍无有效的治疗措施，所以大多数卒中患者遗留有不同程度的后遗症。如何积极有效地开发新型药物预防和治疗缺血性脑卒中是当前研究的重点之一。 左旋丁基苯酞(1-3-n-butylphthalide)又名芹菜甲素(apium graveolens linn)，是从芹菜种籽中分离出的有效成分，根据它的结构式，其异构体右旋丁基苯酞(d-3-n-butylphthalide)被合成出来。之后它们的混合物消旋丁基苯酞(d1-3-n-butylphthalide,NBP)作为临床药物被发展起来[2]，其具有增加缺血区脑血流量和重构缺血区微循环、保护线粒体功能、改善全脑缺血后的能量代谢、减轻神经功能损伤的程度等功能，涉及脑缺血病理的多个环节，对缺血性卒中具有较强的治疗保护作用[3-11]，同时其对脑损伤、惊厥、记忆障碍等疾患也有一定的改善和保护作用[12-14]。NBP于2002年11月正式通过国家食品药品监督管理局(state food and drug administration,SFDA)的审批成为治疗脑卒中的临床药物。 在我们实验室既往的研究中，我们发现,NBP对于高血压大鼠脑卒中发生具有明显的预防作[15]。高血压大鼠脑内血管数量明显减少，血管结构也发生显著改变。在人工寒潮的诱发作用下，大量高血压大鼠发生脑卒中，但NBP可明显减少卒中的发生率，而且它能显著增加脑内血管数量，并改善血管结构的变化。虽然既往所有的实验都能看到NBP各种各样的保护作用，但其发挥保护作用的具体机制还不甚清楚，还有待进一步的研究来阐明。 缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)在缺氧预处理中发挥着重要的作用，它是多种基因转录的调节因子，作为一个转录因子，它参与调节细胞对各种有害刺激的适应性反应。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亚单位组成的异源二聚体转录因子。HIF-1β在细胞中组成性表达，而HIF-1α是HIF-1的调节及活性亚基[16]。在缺氧条件下，HIF-1α得到稳定并聚集，进入到细胞核内与HIF-1β结合形成复合体，结合到各种基因的转录上游区域，调节了数十种基因的表达[17]。其中包括血管再生、能量代谢、细胞凋亡等多种基因[18]，血管内皮细胞生长因子(vscular endothelial growth factor,VEGF)、红细胞生成素(erythropoietin，EPO)等是典型的HIF调节基因。 结合NBP也具有促血管增生、改善能量代谢等多种作用，我们试图探讨HIF是否在NBP保护缺氧条件下损伤细胞中也发挥着重要的调节作用，并阐述NBP调节HIF-1α可能的通路。 既往研究关于线粒体活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)在调节缺氧条件下HIF-1α升高中所发挥的作用，观点各有不同，有的认为缺氧后线粒体内ROS的升高是HIF-1α稳定和聚集的必要因素[19,20]，有的认为线粒体内ROS的产生并不能影响HIF-1α的变化，缺氧后HIF的升高是通过其他途径达到的[21]。ROS和一氧化氮(nitro oxide,NO)所形成的更高活性的亚硝基阴离子(peroxynitrite，ONOO-)，在调节HIF 中也可能发挥重要作用，它可能会升高HIF-1α的羟化，从而达到减少HIF的作用[22]。 基于以上提到的观点，我们也对NBP影响线粒体ROS和细胞内ONOO-的形成进行了观察，以揭示NBP可能的调节细胞内HIF-1α变化的通路。 研究目的： 本实验主要观察，NBP对缺氧条件下损伤的内皮细胞是否发挥保护作用，及可能的保护机制。确定NBP是否通过保护缺氧条件下线粒体功能，调节线粒体内ROS的生成和清除，达到抑制细胞内ONOO-的生成，从而间接的促进缺氧后HIF-1α的更进一步升高，HIF通过调节下游VEGF等多种相关靶基因的表达，从血管生成、能量代谢等各个方面保护细胞的存活，最终发挥抗脑缺血作用。 研究方法： (1)首先观察NBP对缺氧条件下细胞的保护作用以及最合适的NBP保护浓度：分缺氧组和正常氧压两个大组，每组里面设定空白对照组、溶剂组和NBP组。NBP组分出100，10，1，0.1，0.01μmol/L五组。溶剂和NBP组都是在缺氧前给予1小时的药物NBP处理。然后使用MTT比色法确定各个浓度的NBP是否能保护缺氧状态下损伤的细胞，以及这些保护作用是否受溶剂二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)的影响。最后确定发挥保护作用的最佳NBP浓度。 (2)观察NBP对缺氧条件下细胞内转录因子HIF-1α表达的影响：分正常对照组、缺氧+溶剂组、缺氧+NBP组(其中NBP使用最佳浓度10μmol/L)。使用免疫荧光和IPP图像分析确定NBP是否可增加HIF-1α的表达。 (3)观察NBP对缺氧条件下细胞内HIF-1α下游基因VEGF表达的影响：分正常对照组、缺氧+溶剂组、缺氧+NBP组(其中NBP使用最佳浓度10μmol/L)。使用免疫荧光和IPP图像分析确定NBP是否可增加VEGF的表达。 (4)观察NBP对缺氧条件下细胞线粒体内ROS的影响：分正常对照组、缺氧+溶剂组、缺氧+NBP组(其中NBP使用最佳浓度10μmol/L)，使用MitoSOX Red 来显示线粒体内ROS，MitoTracker Green定位ROS产生的部位。使用荧光拍片和IPP图像分析确定NBP是否可调节线粒体内ROS的总量。 (5)观察NBP对缺氧条件下细胞内ONOO-生成的影响：分正常对照组、缺氧+溶剂组、缺氧+NBP组(其中NBP使用最佳浓度10μmol/L)，使用ONOO-下游的产物硝基酪氨酸(nitro-tyrosine,NT)来反映ONOO-产生的量。使用免疫荧光和IPP图像分析确定NBP是否可减少缺氧时ONOO-的生成。 结果： (1)缺氧后内皮细胞的活性明显减低，下降至正常对照组的60％左右。五个浓度的NBP都可显著提高缺氧损伤的内皮细胞的活性，最高可上升到正常对照组的80％，而溶剂(DMSO)组的细胞活性无明显改变，同缺氧对照组相当。在正常氧压下，NBP和溶剂对细胞活性都无明显影响。五个浓度的NBP中从0.01到10μmol/L有着一定的量效关系，10gmol/L能发挥最佳的保护作用。 (2)缺氧后内皮细胞内HIF-1α的量增高，几乎都聚集在细胞核内。使用NBP处理一小时后再缺氧，细胞核内HIF-1α的量得到更进一步的升高。使用IPP图像分析软件进行定量分析，可确定三组间HIF-1α的量具有统计学差异。 (3)缺氧后内皮细胞胞浆内VEGF表达量升高，使用NBP处理一小时后再缺氧，细胞内VEGF生成的量得到更进一步的升高。使用IPP图像分析软件进行定量分析，可确定三组间的VEGF表达具有统计学差异。 (4)缺氧后内皮细胞线粒体内ROS的量增高。使用NBP处理一小时后再缺氧，细胞线粒体内ROS的量得到明显降低。使用IPP图像分析软件进行定量分析，可确定NBP降低线粒体内ROS的量具有统计学意义。 (5)缺氧后内皮细胞内ONOO-的形成增多。使用NBP处理一小时后再缺氧，内皮细胞内ONOO-的形成得到明显抑制。使用IPP图像分析软件进行定量分析，可确定NBP降低了内皮细胞内ONOO-的形成，并具有统计学意义。 结论： NBP可明显增高缺氧条件下损伤的内皮细胞活性，在此模型中以10μmol/L浓度的NBP发挥最佳保护作用。这种保护作用可能是NBP通过影响缺氧条件下HIF-1α的总水平，继而调节HIF下游多种基因转录而实现的。NBP对HIF-1α的调节与其保护线粒体功能，降低线粒体内ROS的生成有关，ROS减少可抑制ONOO-的形成，从而减少HIF-1α的羟化和降解，间接促进了HIF-1α增多。总的来说，在缺氧条件下，虽然缺氧导致的适应性反应可促进HIF-1α的升高，HIF-1α与HIF-1β形成复合体HIF，HIF调节下游基因表达，达到一定的保护作用，但缺氧同时导致的应激反应也会引起线粒体功能的缺失和大量的ONOO-生成，这样大大削弱了适应性反应所产生的保护作用。NBP可通过保护线粒体功能，减少线粒体内ROS的生成，从而减少ONOO-的形成，抑制应激反应产生的损伤，最终促进HIF-1 α水平的进一步升高，达到保护缺氧损伤内皮细胞的作用。