新城疫目前仍是大多数养禽国危害最严重的禽病之一,不仅对养禽业造成危害,还对哺乳动物和人类健康具有潜在的威胁。新城疫由于传染性强,传播速度快,给国家和地区的贸易限制和封锁造成了巨大的经济损失。我国将其列为一类动物疾病。病毒性传染病目前尚没有特异性药物治疗,只能依靠疫苗免疫等进行预防。因此,研究特异高效的抗病毒药物是防治病毒性疫病所面临的一项紧迫课题。近年来出现的反义RNA、RNAi等基因治疗技术,都试图在细胞内对感染的病毒在核酸水平上进行干预,从而达到抑制病毒合成的治疗目的。随着细胞生物学和抗体工程技术的发展,出现了一种新兴细胞内免疫及治疗技术——胞内抗体技术。胞内抗体技术是将小分子抗体导入细胞内引起细胞的一系列生物过程发生改变的技术,该技术通过特异性干扰或阻断细胞内特定生物大分子合成、加工和分泌过程而发挥作用。鉴于新城疫病毒转录复合体蛋白在病毒复制增殖过程中所处的关键环节,本研究拟研制能够与新城疫病毒转录复合体蛋白之一的磷蛋白结合的胞内抗体。通过胞内抗体与P蛋白在NDV感染的细胞内特异性结合,从而对病毒转录复合物形成进行干扰及对病毒增殖进行抑制,为新城疫病毒特效药物的研发以及病毒复制机制的研究提供一种新的思路。为此,本论文从以下几个方面开展研究。1、鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白的单链抗体(sc Fv)的筛选及鉴定(1)鸡源性单链抗体基因表达文库的建立单链抗体是将抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过一段柔性的连接肽(linker)连接所形成的两个可变区首尾相连的单一肽链。通过用NDV VG/GA型疫苗免疫鸡,提取其脾脏总m RNA。设计鸡抗体编码基因特异性引物,采用RT-PCR和PCR技术扩增出抗NDV单链抗体的轻链可变区和重链可变区基因,利用重叠延伸PCR将VH和VL通过一条linker连接起来(VH-linker-VL)构建sc Fv。将sc Fv基因克隆于原核表达载体p OPE101-XP,该载体主要用于单链抗体的表达和筛选。将构建的重组质粒p OPE101-XP-sc Fv转化感受态细胞E.coli JM109,PCR鉴定为阳性的克隆送检测序。挑选测序正确的阳性克隆经IPTG诱导表达,提取周质腔可溶性sc Fv,SDS-PAGE检验表达结果证明成功构建了鸡源性单链抗体表达文库。经计算单链抗体库库容量为3.8×106,可用于下一步单链抗体的筛选。(2)抗新城疫病毒磷蛋白(P)单链抗体的筛选及鉴定根据Genbank中已经发表的禽源性新城疫病毒F48E9磷蛋白的基因序列,设计了一对特异性引物,运用RT-PCR方法从基因组中扩增出P蛋白编码基因的c DNA。P蛋白编码基因全长1287 bp,编码429个氨基酸。同时将测序正确的P蛋白基因序列连接原核表达载体构建重组原核表达质粒p ET-28a-P,进而表达出P蛋白,为筛选针对磷蛋白的单链抗体提供抗原。以纯化后的新城疫病毒磷蛋白为抗原,建立并优化可用于筛选抗NDV磷蛋白sc Fv的间接ELISA方法。从上述构建的单链抗体库中进行筛选,获得两株亲和力较高的阳性克隆sc Fv ZL.17和sc Fv ZL.103。对鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体的基因序列分析,结果表明高变区主要集中于CDR区,碱基变化很大。Western blot分析表明两株单链抗体都能够与病毒的磷蛋白特异性结合。2、抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体在细胞中的表达及生物活性分析为获得针对NDV磷蛋白的细胞内抗体,本研究将上述两个单链抗体编码基因克隆到真核表达载体pc DNA3.1(+),成功构建了针对磷蛋白的胞浆型胞内抗体表达质粒pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17。采用脂质体分别将pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17导入细胞内,通过RT-PCR和Western blot分析证明,在细胞内,其编码胞内抗体的m RNA获得转录,胞内抗体成功表达,间接免疫荧光技术也进一步证实胞内抗体在细胞内获得表达。流式细胞证明重组胞内抗体对宿主细胞活性无显著影响;并且通过Western blot和免疫共沉淀实验评估了表达的胞内抗体在细胞内与新城疫病毒磷蛋白的结合能力,证明胞内抗体能够在细胞内与磷蛋白能够特异性结合。通过亚细胞定位实验发现胞内抗体主要分布于细胞质,与磷蛋白的分布区域正好重叠。抗磷蛋白胞内抗体与新城疫病毒相互作用后,血凝实验检测病毒滴度,结果表明转染细胞内的胞内抗体pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17能够阻断病毒对细胞的侵染,因而对NDV感染的细胞具有保护效果,依次是p CDNA3.1-sc Fv ZL103>p CDNA3.1-sc Fv ZL17>BHK21。通过荧光定量PCR证明,胞内抗体具有干扰c RNA、v RNA和m RNA合成的效果,具有抑制病毒产生的功能。3、可穿膜的重组胞内抗体融合蛋白的表达及生物活性研究上述抗体需要通过脂质体才能导入细胞,既繁琐,效率也不高。为了探索能顺利将抗体导入细胞的方法及构建穿膜型胞内抗体,本研究选择报道的融合穿膜肽HIV-TAT衍生片段CTP512,将其分别和上述筛选的两个单链抗体表达基因融合,导入原核表达载体p ET28a(+),构建穿膜型胞内抗体表达质粒p ET28a-sc Fv ZL-CTP。进行了穿膜抗体生物学特性研究,设计不同穿膜抗体浓度进行穿膜实验,筛选出最佳的穿膜浓度为3μM;MTT法检测CTP融合穿膜抗体对细胞活性的影响,检测发现与对照组相比,穿膜抗体蛋白对细胞的增殖和活力无明显影响;间接免疫荧光实验分析显示,穿膜抗体定位于细胞浆,能与磷蛋白分布区域重叠;TCID50检测穿膜抗体对DNV感染细胞的保护效果,结果显示,穿膜抗体对细胞有明显保护效果,依次是p ET28a-sc Fv ZL103-CTP>p ET28a-sc Fv ZL17-CTP>Control,与空白对照相比差异显著(P≤0.05);荧光定量PCR检测穿膜抗体对细胞内NDV复制及转录的影响,结果显示,穿膜抗体显著降低了NDV的c RNA、v RNA和m RNA的含量,表明其具有抑制NDV复制的功能。本研究结果不仅为跨膜型胞内抗体研究提供了一种新思路,也为研究外源蛋白导入细胞膜的转膜技术提供了有益借鉴。本研究利用基因重组技术,首先成功构建了库容量为3.8×106鸡源性单链抗体库,并从库中筛选到针对磷蛋白的两株单链抗体;根据胞内抗体构建策略,研制了针对新城疫病毒磷蛋白的胞内抗体,实验证实胞内抗体对细胞具有保护效果及干扰新城疫病毒基因在细胞内的复制及转录;成功构建跨膜型胞内抗体导入质粒,使胞内抗体与蛋白跨膜转运区域融合表达,实验证实穿膜抗体定位于细胞浆,且对细胞具有保护效果;荧光定量PCR鉴定穿膜抗体能够干扰新城疫病毒感染细胞后的复制及转录。本研究为研究NDV在细胞内复制增殖机制,筛选细胞内有效抗NDV抗体,进而探索细胞内治疗NDV等病毒感染新途径进行了有益探索。