【摘 要】
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背景及目的人芽囊原虫（Blastocystis hominis,B.hominis）是一种寄生于肠道的机会致病性原虫,分布广泛,其感染后主要导致腹泻、腹痛为主的消化道临床症状,目前致病机制尚不清楚。本研究拟通过透射电镜动态观察感染后大鼠盲肠超微结构的损伤特征,采用q PCR检测大鼠盲肠上皮紧密连接蛋白的表达情况,并通过HPLC-ELSD法检测大鼠肠道通透性变化,同时检测感染后大鼠盲肠上皮细胞凋亡及
【基金项目】
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项目名称:IFN-γ介导的肠黏膜紧密连接破坏在人芽囊原虫感染过程中的作用及机制，项目合同编号:2017GXNXFAA198124，项目来源:广西自然科学基金联合资助培育项目，项目起止时间:2017.09.30-2020.09.29
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背景及目的人芽囊原虫（Blastocystis hominis,B.hominis）是一种寄生于肠道的机会致病性原虫,分布广泛,其感染后主要导致腹泻、腹痛为主的消化道临床症状,目前致病机制尚不清楚。本研究拟通过透射电镜动态观察感染后大鼠盲肠超微结构的损伤特征,采用q PCR检测大鼠盲肠上皮紧密连接蛋白的表达情况,并通过HPLC-ELSD法检测大鼠肠道通透性变化,同时检测感染后大鼠盲肠上皮细胞凋亡及线粒体损伤情况,初步探讨B.hominis对肠上皮可能的损伤机制,为其致病机制的研究及临床诊治提供依据。方法1.感染大鼠模型的建立与取材:将ST7型B.hominis虫体进行传代扩增培养备用,随机将30只雄性SD大鼠分别以感染后第1周、第3周、第6周、第9周进行实验分组,同时设立对照组,每组6只,以10~8个/ml密度的人芽囊原虫滋养体经口感染各实验组大鼠,对照组经口灌胃等体积PBS。分别于感染后第1周、第3周、第6周和第9周处死大鼠,取盲肠组织备用。2.感染大鼠病理观察:通过HE染色观察不同感染时间点大鼠盲肠组织的病理损伤情况;利用透射电镜动态观察盲肠超微结构的损伤变化。3.采用实时荧光定量PCR（q-PCR）检测大鼠盲肠组织中紧密连接胞质蛋白ZO-1、紧密连接跨膜蛋白Claudin-1、Occludin m RNA的表达水平。4.通过高效液相色谱蒸发光散射仪（HPLC-ELSD法）测定感染前后的大鼠尿液标本中乳果糖（lactulose,L）与甘露醇（mannitol,M）的比值,研究大鼠肠道通透性的变化,评价肠道黏膜屏障功能的改变。5.凋亡细胞检测:通过原位末端标记法（Tunel）观察大鼠盲肠上皮细胞的凋亡情况;并用q PCR检测B淋巴细胞瘤-白血病-2（Bcl-2）、凋亡前体蛋白（Bax）在感染大鼠盲肠组织中的表达水平。6.线粒体损伤检测:q PCR检测盲肠组织中8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（OGG1）、脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（Apex1）、信号传导与转录激活因子（Stat3）及蛋白酪氨酸激酶（Src）的m RNA表达水平。结果1.大鼠一般状况比较:各组大鼠外表、日常活动均正常,体重变化差异无统计学意义。对照组大鼠粪便性状完好,无腹泻症状;感染组大鼠粪便与对照组相比湿润度增加,形状不完整,粪便稀软。2.HE染色结果:各感染组大鼠的盲肠上皮黏膜均发现B.hominis虫体入侵。1周组损伤最为明显,部分可见肠上皮微绒毛脱落,胞核深染。3.透射电镜观察:对照组中可见大鼠盲肠上皮细胞线粒体形态呈圆形,超微结构正常;1周组可见线粒体明显肿胀,线粒体嵴呈现弯曲状,损伤与其他感染组相比最为严重;3周组线粒体的肿胀程度较一周组线粒体肿胀程度稍轻;6周组仅部分线粒体出现肿胀变形,且病变程度明显减轻;9周组出现异常形态的线粒体最少,且仅见轻微变形,损伤最轻。4.紧密连接蛋白的检测:与对照组相比,感染组各蛋白的表达有显著变化:在感染后第1周和第3周,ZO-1、Claudin-1、Occludin的m RNA表达均显著下降（P0.05）。5.感染大鼠肠道通透性测定:与对照组相比,各感染组大鼠尿液中乳果糖/甘露醇排除率比值升高,肠道通透性增加。6.TUNLE细胞凋亡观察结果:正常对照组大鼠盲肠上皮组中未见凋亡阳性细胞;各感染组均可见阳性细胞,其中1周组和3周组阳性细胞数较多。7.凋亡基因检测:与对照组相比,Bcl-2在1周组和3周组的表达明显降低（P<0.05）,而Bax的表达水平显著升高（P<0.05）;Bcl-2在6周组的表达量上调,Bax的表达水平下调（P0.05）。8.线粒体损伤相关分子检测:与对照组相比,OGG1、Apex1及Stat3的m RNA表达于1周组和3周组显著升高（P0.05）;Src于感染后1周显著升高（P<0.01）,之后随着感染时间的延长表达量逐渐降低。结论1.B.hominis感染可导致大鼠盲肠上皮细胞超微结构损伤,损伤程度与感染时间有关,感染后第1周超微结构损伤程度最为严重。2.B.hominis感染可能通过引起线粒体的氧化损伤诱导肠上皮细胞凋亡,从而破坏肠上皮细胞间紧密连接,引起肠道通透性升高。
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