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急性髓细胞白血病(AML)是一类造血干细胞的恶性肿瘤,主要表现为骨髓和血液中原始细胞不可调控的增殖和分化阻滞。MicroRNAs (miRNAs)是一类调控基因表达的小RNA分子。以往研究已经发现多种miRNAs在急性髓细胞白血病中异常表达。我们课题组从急性髓细胞白血病患者外周血中分离粒细胞,利用miRNA芯片技术,分别检测4例AML患者和4例正常人外周血粒细胞miRNAs的表达谱。MiRNA芯片数据表明在AML患者外周血粒细胞中有34种miRNAs异常表达,其中20种miRNAs高表达,14种miRNAs低表达。我们从其中选取miR-26a-5p和miR-23b-3p为研究对象,在20例AML患者和12例正常人外周血粒细胞中进一步检测其表达。此外,我们还证明miR-26a-5p和miR-23b-3p共同调控基因PeroxiedoxinⅢ (PrxⅢ)的表达。我们的结果表明miR-26a-5p和miR-23b-3p通过靶向PrxⅢ调控细胞内活性氧(ROS)的水平。干扰PrxⅢ表达后,白血病细胞系K562细胞向单核细胞分化的能力增强。实验数据提示：miR-26a-5p/miR-23b-3p和白血病发生之间可能具有潜在的病理性关联。[研究目的]本课题主要研究AML患者外周血粒细胞中miR-26a-5p和miR-23b-3p的表达,并探索这两种miRNAs对基因PrxⅢ的调控作用。同时探讨PrxⅢ清除活性氧和影响K562细胞分化的能力。[研究方法]为了完成上述研究目的,我们主要采取以下实验方法：1.粒细胞的获取：收集5ml AML患者外周血,加入人淋巴分离液,离心后离心管内液体分为四层,其中沉淀层含有粒细胞和红细胞,利用红细胞裂解液将红细胞除去,即可得到粒细胞。2.测定AML患者外周血粒细胞中miRNAs的水平：应用软件设计特异性引物,Real-Time PCR技术检测miR-26-5p和miR-23b-3p的表达。3.荧光素酶报告载体构建：设计引物,扩增PrxⅢ3’UTR序列并将扩增产物连入荧光素酶报告载体,使用双荧光素酶报告试剂盒检测细胞的荧光强度。4. Western blot:在HEK293和K562细胞中分别转染miR-26a-5p和miR-23b-3pmimics或inhibitors。 TRIzol提取细胞蛋白后利用ECL试剂盒检测其表达量。5.活性氧的检测：收集细胞,加入荧光探针DCFH-DA后,在室温下孵育30min,通过流式细胞仪检测细胞内ROS的水平。6.K562细胞分化实验：接种2.0×105K562细胞于六孔板中,用lOngPMA处理细胞。收集细胞后,室温下孵育抗体30min,细胞流式细胞术检测单核细胞表面标记CD11b的表达。[实验结果]1.AML患者外周血粒细胞miRNAs表达谱：相比于正常人,AML患者外周血粒细胞有34种miRNAs表达异常,其中20种miRNAs高表达,14种miRNAs低表达。2. MiRNA芯片结果的验证：AML患者外周血粒细胞中miR-26a-5p和miR-23b-3p的表达水平分别降低了79%和47%。3.AML患者外周血粒细胞miR-26a-5p和miR-23b-3p的表达：相比于正常人,AML患者外周血粒细胞中miR-26a-5p和miR-23b-3p的表达水平显著降低。4. PrxⅢ是miR-26a-5p和miR-23b-3p共同的靶基因：与对照组相比,升高miR-26a-5p和miR-23b-3p水平后,HEK293细胞的荧光强度分别降低了31%和43%。5. MiR-26a-5p和miR-23b-3p抑制rx3在K562细胞和AML患者外周血粒细胞中的表达：相比于对照组,miR-26a-5p和miR-23b-3p显著抑制K562细胞中PrxⅢ mRNA和蛋白的表达；AML外周血粒细胞中PrxⅢ蛋白的水平明显升高。6. MiR-26a-5p和miR-23b-3p降低HEK293和K562细胞中ROS的水平：干扰miR-26a-5p或miR-23b-3p的表达后,细胞内ROS的水平明显降低。7.PrxⅢ影响K562细胞的分化：干扰PrxⅢ表达后K562细胞向单核细胞分化的能力增强。[结论]本课题揭示了AML患者外周血粒细胞中miRNAs表达谱,其中miR-26a-5p和miR-23b-3p共同调控rxⅢ的表达。PrxⅢ不仅可以清除胞内的ROS,还可以影响K562细胞的分化。总之,本研究对于揭示AML的病理机制和发现治疗白血病的新策略具有一定的潜在价值。