目的结核病目前仍是危害人类健康的主要疾病之一,据世界卫生组织估计,目前全世界有近三分之一的人感染了结核,每年有870万新增病例,其中300万死亡,因此对该病的预防与治疗已成为研究的热点。肾结核病是常见的肺外结核病,肺结核死亡病人尸检显示,并发肾结核者占16-26%。而肾结核早期临床表现不典型,症状轻微,缺乏特异性,诊断比较困难。临床上漏诊误诊率高,使多数病人失去了早期病因治疗的机会,致使晚期进入终末期肾衰,威胁病人生命,故肾结核的早期诊断非常重要。目前尿结核杆菌培养阳性仍是肾结核诊断的金标准,但其时间长、阳性率低。结核菌产生分阶段性,所以早期肾结核的诊断率只占6%,不排菌的肾结核诊断率更低。因此在肾结核病感染的早期,快速的诊断是一项挑战性的课题。结核杆菌对肾脏的损伤分为临床肾结核,病理肾结核和结核性变态反应综合征。所谓结核性变态反应综合征是指当机体对结核感染处于超敏状态时,可在远离原发灶的皮肤、关节、角膜、结膜、肾脏、浆膜腔等多处发生细胞免疫和体液免疫反应,引起类似系统性红斑狼疮,血管炎,角膜炎,关节炎,肾小球肾炎等多种临床表现。结核性变态反应综合征引起肾损伤,可以表现为蛋白尿,血尿,IgA肾病,肾病综合征等。其病理类型为：毛细血管内增生性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎、局灶节段性肾小球肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、微小病变病等多种类型。结核杆菌感染做为这些疾病的病因。若不能及时诊断,及时行病因治疗,而单纯应用免疫抑制剂或激素治疗,结果会导致结核播散,疾病迁延不愈,给患者带来不能弥补的损伤或遗憾。本试验将病例分为三组：肾结核组,非肾结核组,结核杆菌相关肾损伤疑诊组。从以下三个方面进行研究,以探讨结核性变态反应综合症导致的肾损伤的早期诊断方法：1应用实时定量PCR技术,对患者肾组织中结核分枝杆菌DNA表达进行定量分析。2研究上述三组患者肾组织中结核分枝杆菌早期分泌性蛋白抗原85(Ag85)及γ干扰素(IFN-γ)的表达,并分析二者的相关性。3研究结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶(ESAT-6)在上述三组患者肾组织上的表达。材料与方法一、第一部分1、研究对象与分组病例选择：各组病例均来自2005年至2007年在中国医科大学附属第一医院住院患者,平均年龄为42.5±19.5岁,男58例,女32例。肾结核组：因肾结核,行一侧肾切除、病理诊断为肾结核患者30例；非肾结核组：临床诊断肾小球肾炎,无结核感染史,血结核抗体阴性,PPD(—)患者30例。结核杆菌相关肾损伤疑诊组30例：入选标准需具备以下6条：①肾性血尿／蛋白尿；②结核中毒症状：不明原因低热、乏力>1月；③PPD(++—+++)；④肾外结核或结核史；⑤血γ球蛋白增高；⑥血结核抗体阳性。以上病例均留取24小时尿沉渣在罗氏培养基行结核杆菌培养。2、DNA提取(1)将肾组织块剪碎,置于1.5ml离心管中(2)加入消化液500ulTE PH8.0 445ul 10mmolTris/1mmol EDTA10%SDS 50ul终浓度为1%20mg／ml蛋白酶K 5ul终浓度为200ug／ml(3)37C过夜(4)加入等体积的饱和酚500ul,充分混合(5)10000转离心5分钟(6)将水相上一层移入一新管,再加入等体积饱和酚抽提一次(7)将水相上一层移入一新管,加饱和酚和氯仿混合液1：1共500ul混合,10000转离心5分钟(8)取水相加1／10体积的醋酸钠混合,再加2倍体积的-20C冻无水乙醇混合,可见固态结晶。(9)10000转离心5分钟(10)弃上清,加75%乙醇500ul洗一次,把DNA悬起即可(11)10000转离心5分钟(12)弃上清,吸干液体,37C,放置5分钟,干燥(13)TE或去离子水50ul溶解,-20 C保存DNA提取试剂盒(Sigma公司)实时荧光定量试剂SYBR Green (Gene公司)引物合成：以β-actin为内参,β-actin及结核杆菌正向、反向引物由TAKARA公司设计合成。引物序列如下：使用特异性结核杆菌插入序列IS6110作为结核杆菌DNA扩增的目的基因,β-actin正向引物5’-AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G-3’反向引物5’-TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3’结核杆菌正向引物5’-TTG GAA AGG ATG GGG TCA-3’反向引物5’-CGC AGC CAA CAC CAA GTA G-3’预期扩增产物长度为156bp所有的Real-time PCR反应都是在ABI PRISM7700序列检测仪上进行。每一次试验都设立空白对照。应用随机带有的软件进行Real-time PCR数据分析。分别以35和40作为循环次数。二、第二部分1、研究对象与分组本研究所选各组病例均来自2005年至2007年在中国医科大学附属第一医院住院患者,平均年龄为46.1±17.6岁,男40例,女33例。肾结核组：因肾结核,行一侧肾切除、病理诊断为肾结核患者10例；非肾结核组：临床诊断肾小球肾炎,无结核感染史,血结核抗体阴性,PPD(—)患者12例。结核杆菌相关肾损伤疑诊组30例：入选标准同前。以上病例均留取24小时尿沉渣在罗氏培养基行结核杆菌培养。2、实验试剂(1)Ag85一抗,为鼠单克隆抗体,(Anti Mycobacterium tuberculosis Ag85, mouse monoclonal antibody HYT 27),购于丹麦AntibodyShop公司。(2)IFN-γ一抗,鼠抗人抗体,购于上海优宁维生物科技有限公司。(3)免疫组化染色试剂盒正常山羊血清封闭液,二抗山羊抗小鼠IgG,抗原修复液,0.1M PBS,0.01M枸橼酸盐缓冲液,酶-酶抗体复合物,甘氨酸-盐酸缓冲液,DAB显色试剂盒。购于武汉博士德公司。3、实验步骤：免疫组织化学SABC法(1)组织切片：用10%富尔马林固定组织,常规石蜡包埋。切片厚4-6gm,粘附于涂有1mg／ml多聚赖氨酸粘附剂的玻片上,入烤箱60-80℃,6-8小时。(2)脱腊：100%乙醇Ⅰ5min,100%乙醇Ⅱ5min,95%乙醇5 min,90%乙醇5min,70%乙醇5 min,50%乙醇5 min,30%乙醇5 min。(3)蒸馏水新鲜配置3%H2O2,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。(4)热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH6.0),微波炉加热至沸腾后断电,间隔5-10分钟后,反复1-2次。冷却后0.1M PBS洗涤2-3次。(5)滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。去除多余液体,不洗。(6)滴加一抗：400倍稀释的一抗4℃过夜。0.1M PBS洗2分钟,3次。(7)滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃30分钟。0.1M PBS洗2分钟,3次。(8)滴加试剂SABC,37℃30分钟。0.1M PBS洗5分钟,4次。(9)使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水,加试剂盒中A、B、C试剂各一滴,混均后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间,一般在10分钟。蒸馏水洗涤。(10)复染：苏木素轻度复染。脱水透明封片。显微镜观察。4、免疫组织化学结果分析应用中国医科大学医学图像分析系统检测,于肾皮质随机采集5个不含肾小球及动脉的视野(x40倍)测定阳性表达部分的平均光密度值,及其与整个视野面积的比值。5、统计学处理所有数据均用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异具有显著性的标准。并计算Ag85和IFN-γ表达的相关性。三、第三部分1、研究对象与分组同第二部分2、实验试剂ESAT-6,一抗,为鼠单克隆抗体,(Anti Mycobacterium tuberculosis, ESAT-6, mouse monoclonal antibody HYB 076-08),购于丹麦AntibodyShop公司。二抗,山羊抗小鼠IgG、酶亲合素-过氧化物酶复合物SABC,复合消化液,抗原修复液,0.1M PBS,0.01M枸橼酸盐缓冲液,DAB显色试剂盒,购于武汉博士德公司。3、实验步骤免疫组织化学SABC法检测ESAT-6在肾组织上的表达,具体步骤同第二部分。4、免疫组织化学结果分析应用中国医科大学医学图像分析系统检测,于肾皮质随机采集5个不含肾小球及动脉的视野(×40倍)测定阳性表达部分的平均光密度值,及其与整个视野面积的比值。5、统计学处理所有数据均用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异具有显著性的标准。结果一、第一部分30例肾结核组病人中,7例尿培养为阳性,23例为阴性,非肾结核组病例尿培养结果全部为阴性,尿培养的敏感度为23.3%,特异度为100%。实时定量PCR结果显示,以35作为循环次数,25例肾结核组病人阳性,非肾结核组病人4例阳性,敏感度为83.7%,特异度为86.7%；以40作为循环次数,28例肾结核组病人阳性,非肾结核组病人13例阳性,敏感度为93.3%,特异度为56.7%。结核性肾损伤疑诊组：以35作为循环次数,9例肾结核组病人阳性；以40作为循环次数,14例肾结核组病人阳性。肾结核组的CT值为19.64±1.15；结核性肾损伤疑诊组的CT值为23.32±5.32,二者比较P=0.09,无显著性差异。我们跟踪随访了结核性肾损伤疑诊组9例阳性病例一年,其中3例在随后多次尿培养中找到结核杆菌；4例因常规治疗效果不佳,经患者同意后采用抗结核实验性治疗,病情好转；其余2例经常规治疗后病情好转。二、第二部分1、Ag85及IFN-γ免疫组织化学染色结果肾结核组：肾组织中10例均可见Ag85及IFN-γ呈褐色颗粒状阳性物质沉积在肾间质、肾小管细胞的胞浆及部分肾小球系膜区、毛细血管基底膜。非肾结核组：3例可见浅褐色物质片状分布于肾间质,其余病例均未见褐色物质沉积。结核性肾损伤疑诊组：30例肾组织中14例可见褐色颗粒状阳性物质沉积在肾间质、肾小管细胞的胞浆及部分肾小球系膜区、毛细血管基底膜。肾脏病理损伤严重部位阳性物质沉积亦较多。Ag85及IFN-γ表达部位一致。肾结核组、结核性肾损伤疑诊组及非肾结核组Ag85的OD值分别为79.07±19.50,70.60±11.86,15.56±3.39；IFN-γ的OD值分别为50.88±11.61,46.19±14.43,5.93±2.01前两者比较差异无统计学意义(P>0.05),后两者比较差异有统计学意义(P<0.005)。2、对Ag85及IFN-γ进行相关性分析结果表明二者成直线正相关,r=0.9857,p<0.05。3、尿培养及Ag85免疫组化的敏感性及特异性10例肾结核组病人中,3例尿培养为阳性,7例为阴性,非肾结核组病例尿培养结果全部为阴性。尿培养的敏感度为30%,特异度为100%,Ag85免疫组化染色的敏感度为100%,特异度为75%。三、第三部分1、ESAT-6免疫组织化学染色结果肾结核组：肾组织中10例均可见褐色颗粒状阳性物质沉积在肾间质、肾小管细胞的胞浆及部分肾小球系膜区、毛细血管基底膜。非肾结核组：2例可见浅褐色物质沉积于肾间质,其余均未见褐色物质沉积。结核性肾损伤疑诊组：30例肾组织中8例可见褐色颗粒状阳性物质沉积在肾间质、肾小管细胞的胞浆及部分肾小球系膜区、毛细血管基底膜。肾脏病理损伤严重部位阳性物质沉积亦较多。肾结核组、结核性肾损伤疑诊组及非肾结核组OD值分别为53.67±14.21,48.5±9.26,6.47±1.61,前两者比较差异无统计学意义(P>0.05),后两者比较差异有统计学意义(P<0.005)。2、尿培养及ESAT-6免疫组化的敏感性及特异性尿培养的敏感度为30%,特异度为100%；ESAT-6免疫组化染色的敏感度为100%,特异度为83%。结论本研究结果表明：1、荧光定量PCR技术检测肾组织中的结核分枝杆菌DNA,以35作为循环次数,敏感度为83.7%,特异度为86.7%。可以提高检测的特异性,灵敏度和可信性,为临床提供可靠的诊断依据。2、结核分枝杆菌早期分泌性蛋白抗原85及γ干扰素(IFN-γ)在肾结核患者肾组织上的表达增强,且二者呈正相关,Ag85免疫组化染色的敏感度为100%,特异度为75%,Ag85表达阳性提示患者肾组织可能存在结核杆菌感染,临床上需密切观察此类病人,反复进行尿结核杆菌培养,以免出现漏诊及误诊。3、结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6在肾结核患者肾组织上的表达增强,ESAT-6免疫组化染色的敏感度为100%,特异度为83%,ESAT-6表达阳性提示患者可能感染致病性结核杆菌且特异度高于Ag85,可以为结核相关肾损伤早期诊断提供一定的价值。