大多数的多细胞生物在长期的进化过程中形成了一套有效的识别和清除感染病原体的免疫反应系统，即天然免疫(innate immunity)和获得性免疫(adaptive immunity)。病原体在漫长的进化过程中一直保留着一部分结构成分，这种保守分子结构被称作病原体相关分子模式(pathogen—associated molecular patterns，PAMPs)。天然免疫在进化过程中产生了一套天然免疫识别分子，又称模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)来辨别PAMPs并发现病原体的存在。ToⅡ样受体(Toll like receptor，TLRs)是进化中形成的PRRs，从无脊椎动物一直保留到人类，人体Toll样受体家族目前已被确认的成员共有11个，机体感染期间，不同的PAMPs成为“危险信号”，由特定的TLR识别后将启动不同胞内级联通路的活化，最终导致NF-κB的转位与相应免疫基因的活化而转录，导致多种效应分子的基因表达，如炎性细胞因子、趋化因子、共刺激分子、主要组织相容性复合物及多重效应分子等，从而成为生物抵御外物入侵的第一道防线。提示TLRs在诱发宿主先天性免疫防御反应和各种炎症过程中起着重要的作用，并成为联系后天性免疫系统的纽带。人工合成含CpG的寡核苷酸(Oligonucleotides containing CpG motifs，CpG-ODN)为TLR9配体，可与TLR-9结合而最终激活NFκB，诱导多种细胞因子的分泌，提高细胞共刺激分子的表达，刺激B细胞分泌抗体，为激发机体固有免疫反应的重要分子。并且CpG ODN刺激分泌的细胞因子以IL-12为主，可随后诱导Th1型的免疫反应。由於含CpG motif的ODN可激活多种免疫细胞，诱导Th1型的免疫反应，已广泛用于抗病毒，抗细菌感染，抗肿瘤，治疗过敏性疾病研究和作为免疫佐剂用于免疫治疗。免疫系统作为机体防卫危险因素、维持内环境稳态的主要调节体系，其内部存在着错综复杂的相互作用对于广泛表达在天然免疫细胞和特异性免疫细胞表面的TLRs，深入研究其配体识别、信号转导、免疫因子活化等各个环节为进一步认识免疫系统的结构与功能提供了新视角，并为研究疾病发生机制、宿主对疾病的易感性等问题提供了新的启迪。随着免疫学以及生命学科整体的飞速发展，注重进化渊源特点和环境与宿主相互作用关系与结果给免疫学研究带来新的生机，同时也是天然免疫在沉寂多年后重新成为研究热点的客观背景。本实验研究了TLRs配体对大鼠神经干细胞增殖的影响效应及TLR9配体的抗肿瘤活性。第一部分TLRs配体对大鼠脊髓神经干细胞增殖的影响目的：炎症与再生修复在生物进化中是彼此相连的过程。干细胞(Stem cells／progenitor cells)的存在能促使损伤组织的修复与再生，长期以来，中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)的损伤与再生一直是困扰人类健康的难题．无法找到良好的治疗方法，研究证明成体哺乳动物CNS内存在类似干细胞性质的神经前体细胞(neural progenitor cells NPCs)，NPC是中枢神经系统内长期提供新细胞(神经元和胶质细胞)的源泉，将成为CNS疾病治疗的新手段，因此NPCs的发现给因疾病或外伤所致的CNS功能丧失的治疗修复带来了希望。脊髓内的神经干细胞(neural progenitor cells，NPCs)可促使脊髓损伤组织的修复，然而，调节NPCs增殖与分化的机理迄今未明，我们在此研究筛选出了某些Toll样受体(Toll like receptor，TLR)配体经腹腔注射给药后可引起脊髓NPCs增殖。方法：大鼠经单次腹腔注射TLR不同配体，增殖的细胞由BrdU跟踪标记。增殖的NPCs由抗巢蛋白nestin与抗BrdU的双染抗体标记，增殖的Microglia由抗ED-1与抗BrdU双染抗体标记．结果：PS CpG-ODN未引起脊髓NPCs的明显增殖，而Poly l：C、LPS、与R848可引起BrdU~+细胞显著性增加。注射Poly I：C或R848的大鼠脊髓BrdU~+细胞密度于注射后2-3天达最高，随后快速降至正常水平。可见BrdU~+／nestin~+双阳性细胞的存在，提示有增殖的NPCs的存在，很少见ED-1~+／BrdU~+双阳性细胞，提示增殖的非Microglia细胞．此外，伴随NPCs增殖的还有CNS先天免疫系统的激活，如神经小胶质细胞的活化。然而，细胞的增殖及microglia的活性被皮质类固醇药物地塞米松几乎完全抑制，却未受消炎痛的影响。结论：某些TLR的配体被TLR识别后可能参与脊髓内正常神经细胞的发生过程，提示先天性的免疫系统与再生修复过程之间的相互作用的复杂性，PAMPs被TLR受体所识别显示出与炎症性及再生修复过程的紧密相关，这对开发促进组织再生修复的药剂，尤其是中枢神经系统疾病的药物筛选平台来说是一有价值的工具。第二部分TLR9配体CpG-ODN壳聚糖纳米粒的制备及其提高抗肿瘤活性研究目的：肿瘤的基因治疗可通过导入外源寡核苷酸(oligonucleotides，ODN)，改变肿瘤细胞的基因表达，直接杀伤或减缓肿瘤细胞的生长，抑止肿瘤血管形成，激活机体对肿瘤抗原的免疫应答或阻止肿瘤细胞的扩散等方式达到肿瘤治疗的目的。肿瘤的基因和免疫治疗一般要求治疗性ODN能够进入细胞，到达作用靶部位，并在机体内保持足够的稳定性。CpG-ODN可与TLR-9结合最终激活多种免疫细胞，分泌多种细胞因子，诱导Th1型的免疫反应，已广泛用于抗病毒，抗细菌感染，抗肿瘤等疾病研究。壳聚糖作为基因载体的多功能性，有广泛的应用前景，但是国内外目前的研究主要在体外转染阶段，对其在体内转染的研究非常有限。本研究选用壳聚糖作包裹CpG-ODN的包囊材料，制备了壳聚糖-CpG-ODN纳米复合物，并将其注射转染于动物体内验证了其抗肿瘤的生物效应。方法：壳聚糖作包裹CpG-ODN的包囊材料，制备了壳聚糖-CpG-ODN纳米复合物，将其皮下注射于罹患肿瘤的小白鼠，应用MTT法检测了各组CTL杀伤杀伤率，采用ELISA法分析了各组抗瘤细胞因子的分泌情况，运用流式细胞技术检测了各组肿瘤细胞的凋亡率。结果：壳聚糖-CpG ODN纳米粒组的各项抗瘤指标均优于其它组。结论：显示壳聚糖具有增强CpG ODN抗肿瘤的效应，TLR9及其配体CpG ODN在肿瘤免疫监视及抗肿瘤免疫中发挥了一定作用，为CpG ODN用于肿瘤的基因和免疫治疗打下了坚实的基础。总之，越来越多的研究表明非特异性免疫在肿瘤免疫中具有重要作用，TLRs的为我们探索先天免疫与获得性免疫揭开了美好的前景，为各种疾病提供了新的治疗思路，增强TLRs信号通路的试剂可能是抵抗病原生物或肿瘤的较好佐剂，用CpG DNA激活TLR9信号通路可能是多种疾病，尤其对肿瘤来说是新的预防与治疗策略，期望在人体也能获得动物实验一样的结果。在不久的将来，以TLRs为靶位可能是免疫系统失调所致的各种疾病的新的治疗策略，以TLRs为靶位开发新药将是很有前途的免疫治疗措施。