论文部分内容阅读
鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒（DHV,duck hepatitis virus）引起的主要发生于3周龄以下雏鸭的一种传播迅速、高度致死性的传染病。本试验主要对鸭肝炎病毒进行增殖、鉴定和纯化,利用纯化的病毒作为抗原免疫小鼠并建立了间接ELISA筛选方法,并经过一系列的融合筛选成功制备了抗鸭病毒性肝炎的单克隆抗体,从而为实验室建立DVH的快速诊断方法及今后对DHV的研究奠定基础。本试验用鸭胚进行DHV增殖,运用Reed-Muench法测定DELD50为10-7.12,0.2mL;鸭胚中和试验鉴定此DHV为Ⅰ型鸭肝炎病毒;通过氯仿去脂、PEG反透析、DEAE52纤维素层析和超高速离心的纯化方法对病毒进行了纯化。纯化后的病毒经负染在电镜下观察可看到圆形、大小均一、直径约为15nm左右的病毒粒子。用纯化的病毒液接种雏鸭,进行回归试验,可以引起雏鸭“角弓反张”的典型症状与肝脏出血等病理变化。用纯化的病毒作为抗原来免疫BALB/c小鼠后建立间接ELISA筛选方法。细胞融合前经反复试验,确定了间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件,即:抗原包被浓度为50μg/mL,以1:5000稀释的阴、阳性血清分别作为阴、阳性对照,反应条件均以37℃50min为佳,酶标二抗的工作浓度为1:6000。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选出3株阳性杂交瘤细胞株,将获得的阳性细胞株用有限稀释法进行3次亚克隆,筛选出2株能稳定分泌McAb的细胞株,分别命名为1D10和586。对这2株杂交瘤细胞株的稳定性、染色体、亚类、抗原表位特异性、亲和力、腹水效价、特异性进行了鉴定,结果如下:在经过3个月的连续传代和3个月后的复苏检测,其分泌抗体的能力差异不显著,表明其稳定性好;染色体数目平均在84—92条之间;经亚类鉴定,2株杂交瘤细胞分泌的抗体类型均为IgG1亚类,轻链类型均为k链;经抗原表位特异性分析,2株单克隆抗体的识别表位相同或相近;其相对亲和力的测定结果是1D10＞586;抗体效价为1D10＞586,其中1D10株杂交瘤细胞的腹水效价达1:409 600;经过ELISA方法检测2株DHV单克隆抗体与鸭瘟无任何交叉反应,特异性较好。