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第一部分中国肌萎缩侧索硬化患者基因突变特点研究[研究目的]:探索2015年至今欧洲和美洲肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)患者中新报道的 GLE1、ANXA11、TIA1、KIF5A、GLT8D1等5个ALS新致病基因在中国ALS患者人群中的突变频率,并探索中国ALS患者基因突变特点,为今后ALS患者临床遗传咨询及临床基因检测提供循证依据。[研究方法]:入组了 2015年1月至2019年3月就诊于北京协和医院神经科诊并诊断为肯定ALS、拟诊ALS和实验室支持ALS的中国大陆患者,采用一代测序技术(Sanger sequencing)对其中 250 名患者(FALS=20,SALS=230)的 GLE1基因全部外显子进行检测分析;对383名患者(FALS=18,SALS=353,ALS-FTD=12)的ANXA11基因全部外显子进行检测分析;对588名患者(FALS=29,SALS=546,ALS-FTD=13)的TIA1基因11、12、13号外显子进行检测分析;对693 名患者(FALS=33,SALS=645,ALS-FTD=15)的 KIF5A基因 26、27、28 号外显子进行检测分析;对885名患者(FALS=44,SALS=821,ALS-FTD=20)的GLT8D1基因4号外显子进行检测分析。采用重复PCR技术对其中20名ALS合并额颞叶痴呆患者(ALS-FTD)患者进行C90rf72六核苷酸(GGGGCC)n重复突分析。采用全外显子组测序技术(Whole Exome Sequencing,WES)对302名患者(FALS=44,SALS=238,ALS-FTD=20)进行全外显子组的测序分析。[研究结果]:合并Sanger测序和WES测序数据(去掉其中重复患者)分析得出①GLE1基因在本次我们中国大陆ALS队列中致病突变频率为0%(0/532);ANXA11基因致病突变频率为1.1%(7/655);TIA1基因致病突变频率为0%(0/848);KIF5A基因致病突变频率为0.23%(2/885);GLT8D1基因致病突变频率为0%(0/885)。②20名AL以FTD患者中未发现C9r 72基因六核苷酸(GGGGCC)n重复致病突变;③44名FALS患者中所有已知ALS基因致病突变频率由高到低依次为 SOD1(50%)FUS(7%),UBQLN2(2%),VAPB(2%),ANXA11(2%),KIF5A(2%);238名SALS患者中所有已知ALS基因致病突变频率由高到低依次为SOD1(4%),FUS(1%),TARDBP(1%),TBK1(1%),OPTN(1%),其余 SETX、NEFH、ANXA11、NEK1、DCTN1、TBAAA等致病突变频率均在1%以下;20名ALS-FTD患者中ANXA11基因突变频率为10%(2/20),CUBQLN2基因突变频率为5%(1/20),NEFH基因突变频率5%(1/20)。[研究结论]:GLE1、TIA1、KIF5A、GLT8D1等新报道的ALS致病基因不是我国患者人群中的常见致病基因;ANXA1;基因在我国ALS患者中突变频率与欧美患者中的突变比例相当;我国ALS突变谱系与欧洲和北美人群存在明显差异,我国患者中基因致病突变频率最高的为SOD1基因(FALS 50%,SALS 4%);ANXA11基因(ALS-FTD 10%)可能是我国ALS-FTD患者中的常见致病基因。第二部分ALS相关KIF5A基因突变对转录影响研究[研究目的]:探索包括本研究第一部分在内的目前国际报道的全部ALS相关KIF5A基因羧基末端 10 个突变位点c.2987de1A、c.2989delA、c.2993-3C>T、c.2993-1G>A、c.2996delA、c.3019A>G、c.3020G>A、c.3020+1G>A、c.3020+2T>A、c.3020+3A>G对KIF5A基因正常转录的影响。[研究方法]:利用限制性内切酶Bam H1和Mlu 1双酶切-酶联方法将KIF5A基因羧基末端exon25～exon28区域包含内含子在内的正常野生型DNA片段连接到pCAS2载体中构建野生型pCAS2重组质粒。设计相关引物,利用定点诱变技术以野生型pCAS2重组质粒为模板,扩增出分别含有上述10个不同突变位点的突变型pCAS2重组质粒。利用RNA体外剪接实验方法,将上述11个重组质粒分别转染到HEK293T细胞中,提取细胞内的RNA,逆转录扩增,然后进行测序,结果同野生型序列进行比对。[研究结果]:c.2992+3G>A突变位点对KIF5A基因羧基末端序列转录未产生影响。c.2993-3C>T、c.3019A>G、c.3020G>A、c.3020+1G>A、c.3020+2T>A、c.3020+3A>G等6个突变点均造成了 27号外显子的表达跳跃,产生了相同的out-frame 移码突变 p.Asn999Valfs*40。c.2987delA 突变造成了 p.Asp996Alafs*52 移码改变,c.2989delA突变造成了 p.Asn997Metfs*51移码改变,c.2993-1G>A突变造成了 p.Gly998Glufs*50 移码改变,c.2996delA 突变造成了 p.Asn999Metfs*49移码改变。.[研究结论]:ALS患者中发现的KIF5A基因c.2992+3G>A突变位点未对基因正常转录产生影响。其余所有ALS相关的不同KIF5A羧基末端突变造成了相同的结果:第996、997、998、999号氨基酸以后发生移码突变。第三部分ANXA11基因突变分子机制初步探索[研究目的]:初步探索本队列中研究第一部分发现的ANXA11基因突变位点c.107C>G(p.P36R)、c.1471G>A(p.G491R)、c.174-2A>G 对 AnnexinA11 蛋白功能及其基因正常转录产生的影响。[研究方法]:采集携带c.174-2A>G突变患者新鲜外周血,利用RNA体内剪接实验,逆转录RNA为cDNA,扩增测序然后与正常序列比对。去掉正常野生型ANXA11基因cDNA的末端终止密码子的三联碱基,利用酶切酶联方法将其连接到pEGFP-N1载体质粒中构成野生型重组质粒,利用定点诱变方法分别构建还有c.107C>G和c.1471G>A点突变的突变型重组质粒,然后转染到HEK293T细胞内培养36h,多聚甲醛固定细胞,DAPI染料染核,荧光共聚焦显微镜观察突变蛋白ANXA11-p.P36R和ANXA11-p.G491R在细胞中的表达分布位置。利用生物信息学方法分析p.P36R和p.G491R对Annexin A11蛋白局部三维空间结构的影响。[研究结果]:RNA体内剪接实验表明c.174-2A>G突变造成了ANXA11基因exon6的表达缺失,产生了 in-frame大片段缺失突变p.A58_Q187del。ANXA11-p.P36R和ANXA11-p.G491R突变蛋白与野生型Annexin A11蛋白相比在细胞胞质内的聚集增多。生物信息分析提示p.P36R和p.G491R可能破坏了 Annexin A11蛋白局部三维空间结构。[研究结论]:c.174-2A>G突变造成了额exon6的表达缺失,破坏了 Annexin A11蛋白与Calcyclin结合位点。p.P36R、p.G491R突变位点可能改变了 Annexin A11蛋白局部三维空间结构,从而引起了蛋白在细胞质内的异常聚集。