研究背景：　　近些年来，各种病毒性疾病如流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、埃博拉病毒感染等的发病呈日益上升的趋势，严重威胁人们的生命健康，带给家庭和社会沉重的负担。据统计，人和动物约有60％的疾病是由病毒感染引起的，其中流感病毒流行性强、具周期性、有些可人兽共患，因此流感病毒极具危害性。在应对流感等病毒感染中，宿主通过产生多种免疫效应分子如干扰素和抗体等对抗感染，其中Ⅰ型干扰素（TypeⅠInterferon）作为固有免疫应答的重要效应分子，在早期抗病毒免疫中占有尤为重要的作用。　　Ⅰ型干扰素及其他免疫效应分子在抗病毒免疫中具有重要作用，生理及病理情况下Ⅰ型干扰素的调控机制如何，能否从中寻找新的抗病毒治疗策略等是本领域研究者普遍关注的课题。我们前期研究关注固有免疫调控机制的研究，基于芯片技术发现抑制性免疫检查点分子T细胞免疫球蛋白及粘蛋白3（T-cell-Ig-muci n-3，Tim-3）负性调控巨噬细胞中Ⅰ型干扰素相关分子如RIG-I（retinoic acid-i nducible gene I）、IFI44（Interferon inducible factor44）、ISG15（Interferon sti mulated gene15）等的表达。基于此，Tim-3是否通过抑制Ⅰ型干扰素参与抗感染免疫的调控，其临床意义如何成为我们重点关注的课题。　　Tim-3是一最初发现于活化的T效应细胞上的免疫细胞活性调控分子，按照结构来说属于Tim家族成员。Tim-3与其配体半乳凝素9（Galectin-9，Gal-9）结合后能够诱导细胞凋亡，或者通过其他机制抑制T效应细胞（Th1/Th17/Tc1）的功能，维持T细胞的稳态。Ti m-3表达异常与多种免疫相关疾病如自身免疫病、肿瘤及病毒感染的关系越来越受到人们的重视，被认为是继CTLA-4、PD-1之后一种新的免疫治疗靶点。　　除了表达在活化的T细胞上外，Tim-3还表达在人和鼠的固有免疫细胞上。Tim-3信号对固有免疫反应的调控机制目前尚不十分清楚，此方面研究近来引起人们的普遍关注。鉴于巨噬细胞等固有免疫细胞在抗病毒感染中处于一线防御地位，在感染情况下Tim-3信号如何调控巨噬细胞的功能，如何通过调控固有免疫反应影响抗病毒感染的进程是非常值得探讨的课题。　　我们实验室较早关注Tim-3信号对固有免疫的调控作用。已有研究显示Tim-3在脓毒血症（Sepsis）中的功能或表达异常与体内单核巨噬细胞的异常活化有关，随后证实Tim-3可以通过抑制LPS诱导的NF-kB活化等机制负性调控巨噬细胞的功能，这提示Ti m-3信号对巨噬细胞的免疫功能负性调控作用，但具体的分子机制尚需要进一步探讨。我们的研究提示Tim-3有可能是巨噬细胞潜在的调控靶点。　　Tim-3分子胞内段较短，不存在像其他负性免疫调控分子（如PD-1）一样的抑制性基序，因此目前对于该分子发挥抑制作用的分子机制研究存在一定的困难。近年来哈佛大学医学院的Kuchroo教授的课题组一直在关注Tim-3信号在T细胞稳态调控中的作用，他们发现Bat3（HLA-B-associated transcript3）和CEACAM1（carcinoembryonic antigen celladhesion molecule1）参与了Tim-3信号对T细胞的负性调控过程，但该研究聚焦在T细胞。Ti m-3信号如何抑制固有免疫细胞、其胞内的信号通路是迫切需要回答的课题。　　基于我们前期的研究基础，Tim-3信号是否通过抑制固有免疫应答调控机体的抗感染免疫进程，如果是，其分子机制如何成为本论文要重点回答的课题。　　目的：　　1、以H1N1（PR8）病毒感染为模型，明确Tim-3信号对H1N1病毒感染的影响；　　2、在H1N1病毒感染小鼠体内以及在巨噬细胞中明确Tim-3信号对Ⅰ型干扰素及其相关分子的调控作用；　　3、重点阐明Tim-3信号调控巨噬细胞Ⅰ型干扰素信号通路的分子机制。　　方法与结果：　　1、Tim-3信号负性调控体内外抗H1N1免疫反应：　　1.1 Tim-3信号负性调控体内抗H1N1免疫反应，加重组织损伤。我们建立小鼠的早期H1N1感染模型，发现与野生型（WT）小鼠相比，Tim-3转基因（Tim-3 TG）小鼠H1N1滴度升高，肺病理损伤加重；在感染H1N1的WT小鼠体内注射可溶性Tim-3蛋白（soluble Tim-3,sTim-3）阻断Tim-3信号后，小鼠H1N1滴度降低，肺病理损伤改善，表明Tim-3信号对体内抗H1N1感染发挥抑制作用。　　1.2 Tim-3信号抑制重要的固有免疫细胞——巨噬细胞的抗H1N1病毒免疫反应。我们用H1N1病毒感染巨噬细胞，巨噬细胞中Tim-3表达水平升高并伴随高载量H1N1病毒；瞬转Tim-3质粒以过表达Tim-3，巨噬细胞病毒载量升高；阻断Tim-3信号后巨噬细胞病毒载量下降。　　2、体外及体内实验发现Tim-3信号抑制Ⅰ型干扰素及其相关分子的表达：　　为了初步探讨Tim-3信号抑制抗H1N1感染免疫的机制，我们：　　1）通过芯片数据分析了Tim-3信号影响免疫功能的可能机制，发现Tim-3信号抑制巨噬细胞中Ⅰ型干扰素相关分子的表达；　　2）在体内实验中，分析了干预Tim-3信号对H1N1感染小鼠体内Ⅰ型干扰素及其相关分子表达的影响，结果发现Tim-3信号抑制体内Ⅰ型干扰素及其相关分子的表达；　　3）在体外试验中，通过阻断Tim-3信号，沉默以及过表达Tim-3的方法，并通过Q-PCR、Western blot、ELISA等技术验证了Tim-3信号对Ⅰ型干扰素相关分子表达的影响，结果发现Tim-3信号抑制巨噬细胞中Ⅰ型干扰素的表达，同时对RIG-I、IFI44、ISG15等分子发挥抑制作用。　　3、Tim-3信号抑制Ⅰ型干扰素及其相关分子表达的分子机制探讨　　鉴于RIG-I在感应H1N1病毒以及在调控Ⅰ型干扰素表达中的关键作用，本研究重点是“Tim-3信号通过调控RIG-I的表达及功能来调控Ⅰ型干扰素及相关分子的表达”，并对这一研究假设进行了验证。　　3.1 Tim-3通过转录因子STAT1抑制RIG-I在巨噬细胞的表达。我们在Tim-3沉默体系发现，敲低Tim-3后RIG-I的转录水平显著上调，而STAT1的抑制剂fludarabine显著下调RIG-I的转录水平和蛋白水平；我们还分析了RIG-I的启动子序列并将 RIG-I启动子区整合到 PGL3荧光素酶报告基因载体上，构建了STAT1和Tim-3真核表达质粒，在双荧光素酶报告体系中发现STAT1会显著提升RIG-I转录水平，而Tim-3过表达抑制由STAT1所激活的RIG-I转录。该实验结果提示Tim-3抑制STAT1对RIG-I的转录激活。　　3.2 Tim-3在转录后水平调控RIG-I的泛素化。　　泛素化修饰是调控RIG-I功能的一种重要方式，我们探讨了Tim-3是否以及如何参与RIG-I泛素化的调控。　　3.2.1 Tim-3与RIG-I之间存在相互作用和共定位。我们利用免疫共沉淀（Co-IP）的方法检测，内源和外源表达的Tim-3/RIG-I之间都存在相互作用；共转RIG-I/Tim-3荧光载体并在激光共聚焦显微镜下观察发现两者之间存在共定位。　　3.2.2Tim-3信号上调RIG-I K48连接的泛素化（RIG-I在蛋白酶体降解的标记），下调K63连接的泛素化（RIG-I活化的标记）。我们通过IP的方法检测了在有无Tim-3表达的情况下RIG-I泛素化水平的变化，发现Tim-3过表达会促进RIG-I K48连接的泛素化，并进而促进RIG-I的降解；Tim-3过表达抑制RIG-IK63连接的泛素化。而Tim-3胞内段缺失突变后，上述两种调节泛素化的效应消失。　　3.2.3 Tim-3与A20共同参与RIG-I的泛素化调控。首先，我们进一步通过Co-IP和Confocal的实验发现，Tim-3与A20、RIG-I这两个分子之间同时存在相互作用和共定位；A20参与Tim-3对RIG-I K48和K63这两种形式的泛素化调控，其作用结果是促进RIG-I在蛋白酶体的降解，抑制RIG-I信号的活化。　　3.2.4 Tim-3通过 A20/RIG-I/IRF-7(IRF-3)轴调节Ⅰ型干扰素表达。我们在Tim-3信号阻断体系，Tim-3基因沉默体系和 Tim-3过表达体系中发现，Tim-3与A20联合，通过调控RIG-I K48/K63连接的泛素化来促进RIG-I降解并抑制RIG-I的活化并进而抑制IRF-3/7的磷酸化。提示存在Tim-3/A20-RIG-I-IRF-3/7-Ⅰ型干扰素调节轴。　　结论：　　本研究重点探讨了Tim-3信号影响抗病毒免疫的分子机制，本研究的创新点在于：　　1）Tim-3在病毒性感染中的研究中多关注T细胞，我们重点阐明了病毒感染过程中Tim-3抑制固有免疫功能的分子机制；　　2）我们阐明了Tim-3对RIG-I这一关键病毒受体的负性调控机制，发现了Tim-3/A20- RIG-I-IRF-3/7-Ⅰ型干扰素调节轴的存在，为进一步了解这一分子的调控功能提供了新的实验依据。　　本研究通过探究Tim-3、Ⅰ型干扰素调控以及病毒感染之间的相关性，进一步明确了将Tim-3作为病毒感染干预靶点的可行性，为相关疾病的临床干预提供了新的策略及思路。