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蓝舌病是一种由昆虫媒介传播的家畜传染病,其病原蓝舌病毒是呼肠孤病毒科环状病毒属的代表性成员。在一些国家蓝舌病被划分为新发传染病,该病感染绵羊群后可导致巨大损失。蓝舌病经常发生于热带和大部分温带地区,这与其传播媒介库蠓（Culicoides）的地理分布一致。蓝舌病毒在禁用弱毒疫苗无疫区的传播已经提示人们研制新一代疫苗非常必要。研制亚单位疫苗无疑是一种有前景的替代策略。BTV亚单位疫苗的主要蛋白为外层衣壳蛋白VP2,该蛋白是主要的中和抗原,VP2可与其他衣壳蛋白（VP5）和核心蛋白（VP3和VP7）共表达形成一个类似于完整BTV的病毒样颗粒（VLP）。本研究的主要工作集中在BTV亚单位疫苗的研制及免疫效果评价。该研究工作包括三部分:（1）BTV16VP2、BTV16VP3、BTV16VP5、BTV16VP7、BTV1VP2、BTV1VP5和BTV8VP2蛋白在杆状病毒表达系统中的表达本研究中我们首先用杆状病毒表达系统成功地表达了7种蛋白并进行了纯化,包括BTV16VP2、BTV16VP3、BTV16VP5、BTV16VP7、BTV1VP2、BTV1VP5和BTV8VP2,目的是将其免疫动物研制有效的BTV亚单位疫苗。杆状病毒表达系统能对表达的蛋白质提供正确折叠并增强蛋白可溶性。对每种蛋白的表达条件进行了优化,包括表达时间、温度、蛋白与Ni-NTA树脂的结合条件、pH值、结合和洗脱缓冲液等,以上所有蛋白被成功表达,且获得了大量纯化的VP2、VP3和VP7蛋白。（2）BTV-16 VP3、VP7、NS2、VP5-41aa蛋白在大肠杆菌中的表达PCR扩增获得BTV-16 VP3、VP7、NS2和VP5-41aa基因并分别与pET32a、pPROEX-HTb和pSMK质粒载体连接,构建的重组质粒pSMKBTV16VP3和pSMKBTV16VP7转化BL21-codon Plus（DE3）-RIL感受态细胞,pET32aBTV16VP5-41aa和pPROEX-HTbBTV16NS2质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,对每种蛋白的表达条件进行了优化,带有His-sumo标签的VP3和VP7蛋白在低温下（16°C）其可溶性大大增加,然而带有His标签的NS2在37°C条件下为可溶性表达,而VP5-41aa蛋白以不可溶性的包涵体形式表达,所以对其进行复合型纯化以增强蛋白的复性。另外,原核表达的VP3和VP7蛋白在去除His-sumo标签后可在体外可装配成病毒核心样颗粒（CLP）。3、BTV亚单位疫苗在BALB/c小鼠和绵羊上的免疫原性评价中国曾从临床感染的绵羊分离到了BTV-16毒株,因此本研究的主要目的是研制针对BTV-16的亚单位疫苗,同时我们也尝试了异源血清型疫苗保护的可能性。为了评价表达蛋白的免疫原性,五种不同组合的蛋白经MontanideTM ISA201佐剂乳化后皮下免疫接种至绵羊和BALB/c小鼠（每组5只动物）,结果显示,与空白对照组相比,免疫动物均产生了很高的BTV血清抗体,且该疫苗诱导产生了蛋白特异的体液免疫应答和明显的淋巴细胞增殖反应。血清中和试验表明,针对BTV-1、BTV-8和BTV-16的亚单位疫苗抗体均能有效中和BTV-1病毒。本研究研制的重组蛋白亚单位疫苗有希望成为防控蓝舌病的新型候选疫苗。总之,在本研究中我们首先用两种表达系统表达了8种不同血清型的BTV蛋白,系统地鉴定了表达蛋白的特异性,优化了蛋白纯化方法,评价了表达蛋白的免疫原性,研制了由BTV-16 VP2、VP3、VP7、NS2和VP5-41aa五种蛋白组合的候选亚单位疫苗,同时也评价了以BTV1VP2或BTV8VP2替换BTV16VP2构建不同血清型嵌合亚单位疫苗的可能性。本研究研制的重组亚单位疫苗诱导产生了显著的体液免疫和细胞免疫应答,且产生的免疫血清能不同程度地中和BTV-1病毒,提示该疫苗可能对不同血清型的BTV产生交叉保护,因此该重组亚单位疫苗策略可参考当地的BTV流行病学进一步优化,从而应对多个血清型BTV的暴发和流行。