【摘 要】
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番茄(Solanum lycopersicum)是一种在世界范围内广泛栽培食用的典型浆果类植物,高温、干旱等极端恶劣天气出现,对番茄授粉受精、果实发育等过程带来不可逆的伤害。亮氨酸拉链蛋白(Homeodomain-Leucine Zipper,HD-Zip)转录因子是植物中特有的一类转录因子,在调控植物的生长发育、器官组织形态的建成以及对生物和非生物胁迫的应答反应方面有着一定的调控作用。在拟南芥中
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番茄(Solanum lycopersicum)是一种在世界范围内广泛栽培食用的典型浆果类植物,高温、干旱等极端恶劣天气出现,对番茄授粉受精、果实发育等过程带来不可逆的伤害。亮氨酸拉链蛋白(Homeodomain-Leucine Zipper,HD-Zip)转录因子是植物中特有的一类转录因子,在调控植物的生长发育、器官组织形态的建成以及对生物和非生物胁迫的应答反应方面有着一定的调控作用。在拟南芥中,HD-ZipⅢ亚族被认为与植物的维管束发育,叶片极性建立,胚胎发育,生长素合成运输等过程相关,但是HD-ZipⅢ对于果实发育的影响目前还没有报道。SlHB8(Solyc08g066500)是番茄中HD-ZipⅢ家族基因的一员,在番茄的各个组织中均有表达。为了探究该基因对番茄生长发育的影响,本实验通过基因克隆,生物信息学分析,表达特性分析及功能验证等分子生物学手段来探究SlHB8的生物学功能,为进一步研究其对番茄生长发育分子机理提供基础。主要研究结果如下:1.本研究采用RT-PCR方法从番茄中克隆获得了1个编码HD-ZipⅢ转录因子的基因SlHB8。序列分析表明,SlHB8全长2523 bp,编码841个氨基酸,含有HD,b Zip,START和MEKHLA 4个保守结构域。系统进化树分析表明,SlHB8与拟南芥的ATHB8的同源性最高。2.定量PCR的结果表明,SlHB8在番茄(Mic-Tom)茎中的表达量最高,其次是根,再次是叶片。在不同时期发育中的果实组织表达量较低。坐果后SlHB8表达量上升。3.利用PLACE和Plant CARE对SlHB8启动子区域的顺式作用元件进行预测分析发现,SlHB8启动子含有赤霉素、脱落酸、水杨酸、热激、伤害、干旱等顺式作用元件。4.SlHB8在经过生长素、赤霉素、脱落酸、水杨酸处理后呈现先上升后下降的趋势,在处理1h后表达量升高,在处理6h,12h后表达量下降。而在乙烯处理后,SlHB8的表达量在各时期均显著降低。5.SlHB8在高温和伤害处理下在1h,6h的表达量显著降低,在12h时表达量不变。在低温和干旱处理条件下,SlHB8的表达量均在处理6h时表达量下降。不同的是,低温处理下SlHB8的表达量在12h时恢复到初始水平,而干旱胁迫下,SlHB8的表达量持续降低。6.本研究利用gateway克隆技术,通过同义突变SlHB8的mi R165/6识别位点来构建该基因的植物超表达载体,包括组成型启动子35S驱动的超表达载体35S::SlHB8Ris以及果实特异性超表达载体2A11::SlHB8Ris。通过农杆菌介导法获得9株35S::SlHB8超表达植株与13株2A11::SlHB8超表达转基因植株分别命名为35S::SlHB8 1~9,2A11-1~13。通过PCR检测鉴定阳性转化植株,并对T0代阳性植株进行q RT-PCR表达量分析,结果表明阳性转化植株中SlHB8的表达量均有不同程度的提高。7.对35S::SlHB8超表达植株进行表型鉴定发现,与野生型番茄相比,35S::SlHB8转基因植株的叶片卷曲,气孔数量增加,茎粗减小,维管束木质化减少。超表达SlHB8同时导致花粉活力下降,花粉管萌发减少,果实座果率下降,并形成无子果实。转基因植株35S::SlHB8的果实提前成熟,果实大小以及重量均减少,可溶性固形物含量极显著提高,色泽并未和野生型果实产生区别。综上所诉,SlHB8参与了番茄植株维管束发育、叶片发育、以及番茄的生殖生长过程,超表达该基因导致番茄的正常生长发育受到影响。但是,该基因是如何调控番茄果实发育的还有待进一步的研究,本实验转基因植株的获得为进一步的研究其分子机理奠定了基础。
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