东北林蛙是我国重要的食用、药用经济动物,其皮肤中含有大量的生物活性物质,具有特殊的分子结构和复杂多样的功能,有较大的开发利用潜力和重要的应用价值。目前东北林蛙皮肤制品已经在食品工业方面有了一定的开发和利用,比如其提取物被用作果蔬防腐剂和保健品。林蛙皮肤在抵御病原微生物侵染的免疫防御中发挥着重要的作用,而细胞因子则是免疫反应中重要的调节因子。本项研究主要研究东北林蛙皮肤中免疫因子的表达,为阐明林蛙皮肤的免疫调节功能提供依据,对科学、有效、合理利用东北林蛙资源具有重要意义。本研究选取东北林蛙背部皮肤组织,通过酶联免疫吸附实验测定三种重要的细胞因子,即白细胞介素1β(IL-lβ)、白细胞介素6(IL-6)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)在林蛙皮肤蛋白提取液中的浓度;通过苏木精伊红染色,观察东北林蛙皮肤的组织结构;通过免疫组织化学染色、免疫印迹等实验,研究三种细胞因子以及白细胞介素1受体1(IL-1R1)的蛋白表达水平。同时,用实时定量PCR方法,在分子表达水平验证这三种免疫因子的表达。为了研究介导这些细胞因子产生所通过的信号通路途径,以免疫组织化学、免疫印迹和实时定量PCR等实验方法,研究识别病原相关分子模式的主要受体——Toll样受体4(TLR4),以及其信号通路相关因子——髓样分化因子88(MyD88)、白细胞介素1受体相关激酶4(IRAK4)、核转录因子κB(NF-κB)在林蛙皮肤中的表达以及表达水平的变化。研究结果表明:(1)组织学结果显示繁殖期和冬眠前期的东北林蛙皮肤主要由真皮和表皮构成。表皮细胞分为角质层,颗粒层,棘细胞层和生发层;真皮中分布着颗粒腺和粘液腺。表皮和真皮中间分布着色素细胞;(2)免疫组织化学结果显示IL-1β、IL-1R1、IL-6和TNF-α在繁殖期和冬眠前期的林蛙皮肤中均有表达,主要表达在表皮细胞和腺细胞;免疫印迹结果表明繁殖期和冬眠前期的IL-1β的蛋白表达没有显著性差异;IL-1R1、IL-6和TNF-α在冬眠前期的林蛙皮肤中有较高表达,酶联免疫吸附实验检测到IL-1β、IL-6与TNF-α的浓度;实时定量PCR结果表明林蛙皮肤中有IL-1β、IL-6与TNF-α的mRNA的表达;(3)在蛋白水平和分子水平上,TLR4在林蛙皮肤中都有表达,在冬眠前期的皮肤中蛋白表达较高;MyD88、IRAK4与NF-κB在蛋白与分子水平上均有表达,NF-κB在冬眠前期的林蛙皮肤中的表达量显著增加。上述结果表明,林蛙的皮肤具有分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的能力。IL-1R1的表达说明林蛙皮肤可以合成IL-1β;TLR4、MyD88、IRAK4与NF-κB的表达说明三种细胞因子的产生可能通过TLRs、MyD88信号通路调节,最终参与炎症过程,调节免疫反应。