花椒枯穗病是新发现的一种病害,引起叶片枯斑和穗轴坏死,造成花椒穗枯死。该病害发生速度快,严重影响其产量与品质,经济损失较大,但病原尚不清楚。为有效控制该病害,本试验利用组织分离培养法对其病原物进行了分离,经柯赫氏法进行了致病性鉴定,最后对病原菌进行种属鉴定,确定其分类地位。药用菊花是我国传统药材,具有药用、食用等多重价值。生产实践中,药用菊花受多种病害的影响,如菊花褐(黑)斑病,枯萎病,根腐病,矮化病等,这些病害发生普遍且为害严重,导致菊花品质大幅下降从而带来经济损失。生物防治是防治药用植物的安全方法之一,本试验以花椒枯穗病和菊花褐斑病为研究对象,筛选对病菌具有拮抗菌作用的植物内生细菌,对该拮抗菌进行生理生化和分子鉴定,标记及定殖,同时进行了液体发酵条件优化、抑菌机理研究,为花椒枯穗病和菊花褐斑病的生物防治奠定理论基础。主要研究结果如下:1利用组织分离培养法分离到菌株E-1,经柯赫氏法则进行致病性鉴定,生物学和真菌ITS特异性引物扩增对该菌株进行鉴定,结果E-1的生物学特征与互隔链格孢(Alternaria alternata)的相同,序列与互隔链格孢的同源性高达100%,推论引起花椒枯穗病的病原菌为互隔交链孢。2从药用菊花、薏米等植物体分离到158株植物内生细菌,根据对峙培养法和抑菌圈法,筛选出菌株Y-1对花椒枯穗病和菊花褐斑病菌的抑菌作用最强。通过生理生化实验和16S rDNA序列分析,拮抗菌Y-1属于芽孢杆菌属(Bacillus)。3采用双抗标记法即抗利福平和抗病原真菌,对拮抗菌Y-1进行标记。将拮抗菌Y-1的突变菌株在160μg·mL-1利福平的NB培养基中振荡培养(28℃,200 r·min-1) 24 h后(浓度约为3×105 cfu·mL-1),采用土壤浇灌法在菊花组培苗上接种,结果,在菊花植株体内回收到细菌菌株。回收菌株的菌落形态、颜色生理生化鉴定结果等均与原始菌株一致,拮抗效果也与原始菌株相似。证明拮抗菌Y-1是内生细菌,可以在菊花植株体内定殖。4通过单因素试验对拮抗菌株Y-1的最适培养基、最佳液体摇瓶条件进行了筛选。结果表明:液体发酵的最佳培养基为LB培养基,250 mL三角瓶最佳装液量为50 mL,最佳发酵pH值为7.0,温度为34℃,接种量为2%,培养时间为32 h,摇床转速为200 r·min-1。该条件下拮抗菌Y-1的产抗菌物质能力最强。5通过对拮抗菌Y-1产挥发性抗菌物质、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶、β-1,3葡聚糖酶能力的测定,发现拮抗菌Y-1产物具有纤维素酶和蛋白酶活性。通过显微观察,菌株Y-1的发酵滤液能有效抑制病原菌丝的生长,并且导致菌丝干枯、断裂、粗细不均、细胞壁破损、原生质溢出、出现空腔等现象。研究明确引起花椒枯穗病的病原为Alternaria alternata。筛选获得的Y-1生防菌为内生生防菌株,属于芽孢杆菌。其代谢产物具有纤维素酶活性和蛋白酶活性,其与病原物作用时具有很好的拮抗作用。