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背景：无论是缺血性脑损伤,还是创伤性脑损伤,它们所导致的神经损伤通常在损伤的当时并未完全表现出来,而是随着损伤后数小时或几天甚至几周而进展。大量的研究已经证实：发生这些病理生理改变背后的潜在机制与血管生成素信号通路(Ang/Tie2)功能的改变密切相关。因此,在缺血早期干预和调控Ang/Tie2信号通路可能是脑保护一种有效的措施和策略。在过去十年,对于不饱和脂肪酸(主要是二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸)对健康的益处吸引了研究者越来越多的兴趣。目前的研究结果表明：无论在脑损伤的急性期,还是慢性期给予都能发挥其神经保护作用。然而,目前极少关于二十二碳六烯酸脑保护作用与Ang/Tie2信号通路相关的机制研究。目的：研究二十二碳六烯酸对缺氧/缺血条件下,脑血管内皮细胞和胶质细胞血管生成因子生成和表达的影响,以及其调控Ang/Tie2信号通路的作用机制。方法：1、随机数字法将大鼠脑微血管内皮细胞(BMVECs)、星形胶质细胞分为正常对照组、氧糖剥夺组(OGD组)、OGD+10μMDHA组、OGD+40μMDHA组、OGD+10μMDHA+GW9662组、OGD+40μMDHA+GW9662组。ELISA检测2、6、12、24h时间点的培养上清液Ang1、Ang2、VEGF,以及培养24h后的细胞凋亡率。2、随机数字法将星形胶质细胞随机分为正常对照组(Ⅰ)、OGD组(Ⅱ)10μMDHA预处理组(Ⅲ)、10μMDHA预处理组(Ⅳ)。除正常对照组在5%C02和95%空气条件下培养外,其余各组经94%N2：5%CO2：1%02低氧条件下培养,所有组培养时间均为24h。收集培养24h时间后的各组上清液。采用随机数字法将BMVECs随机分为正常对照+星形胶质细胞培养上清液Ⅰ(A组)、OGD+星形胶质细胞培养上清液Ⅱ(B组)、OGD+星形胶质细胞培养上清液Ⅲ(C组)、OGD+星形胶质细胞培养上清液Ⅳ(D组)、OGD+星形胶质细胞培养上清液Ⅲ+sTie2Fc(E组)、OGD+培养上清液IV+sTie2Fc(F组)。利用流式细胞技术检测细胞的凋亡率,Western blot检测细胞pTie-2、pAkt、 Bax、Bcl-2、caspase-3、ZO-1。3、随机数字法将BMVECs分为4组：对照组、OGD组、10μMDHA预处理组、40μMDHA预处理组、OGD+10μMDHA+GW9662组、OGD+40μMDHA+GW9662组。利用ELISA检测培养上清液中的Ang2、VEGF、PGE2、PGI2的分泌量；实时荧光定量RT-PCR检测Ang2mRNA和VEGFmRNA; Western blotting检测COX-2蛋白表达。对Ang2mRNA和VEGFmRNA、PGE2、PGI2分泌、COX-2蛋白表达做相关分析。4、随机数字法将BMVECs分为7组：正常对照组、正常对照+Ang1组、OGD组、OGD+Ang1组、OGD+40μMDHA组、OGD+40μMDHA+Ang1组、OGD+40μMDHA+Ang1+GW9662组。流式细胞技术检测细胞凋亡,Western blot检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Tie-1、Tie-2、pTie-2、pAkt、ZO-1。结果：1、与正常对照组比较,其余组脑血管内皮细胞和星形胶质细胞凋亡率均明显增加(P<0.01)；与OGD组比较,OGD+10μMDHA组和OGD+40μMDHA组细胞凋亡率明显降低(P<0.01),而OGD+10μMDHA+GW9662和OGD+40μMDHA+GW9662DHA组细胞凋亡率无明显差异；与OGD组比较,OGD+10μMDHA组和OGD+40μMDHA组两种细胞所有时间点的Angl分泌量均明显增加,而Ang2和VEGF分泌量均明显降低(P<0.01)；与OGD组比较,OGD+10μMDHA+GW9662和OGD+40μMDHA+GW9662组Ang1、Ang2和VEGF分泌量无差异(P>0.05)。与OGD+10μMDHA组比较,OGD+40μMDHA组结果均有明显差异(P<0.01)。2、与A组比较,其余各组血管内皮细胞凋亡率均明显增加(P<0.01)；与B组比较,C和D两组细胞凋亡率明显降低(P<0.01)；与B组比较,E组和F组细胞凋亡率仍有差异(P<0.01),但与C组比较,E组细胞凋亡率有了明显增加(P<0.01)；与D组比较,F组细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。Western blotting结果显示,各组之间内参蛋白β-actin表达无差异(P>0.05)；与A组比较,其余各组Bax、Caspase-3表达明显增加(P<0.01),Bcl-2、Bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1表达明显降低(P<0.01)；与B组比较,C和D两组细胞Bax、Caspase-3表达明显降低(P<0.01),Bcl-2、Bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1表达明显增加(P<0.01)；与B组比较,E组和F组Bax、Caspase-3仍有降低(P<0.01),Bcl-2、Bcl-2/Bax、 pTie-2、pAkt、ZO-1表达增加(P<0.01),但与C组比较,E组细胞Bax、Caspase-3表达明显增加(P<0.01),Bcl-2、Bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1表达明显降低(P<0.01)。与D组比较,F组细胞组Bax、Caspase-3、Bcl-2、Bcl-2/Bax、pTie-2、 pAkt、ZO-1表达均有明显差异(P<0.01)。3、与正常对照组比较,氧糖剥夺下OGD组和DHA预理组Ang2、VEGF、 PGE2、PGI2的分泌明显增加(P<0.05),且Ang2mRNA和VEGFmRNA相对表达率和COX-2蛋白表达上调(P<0.05)；但与OGD组比较,10μMDHA预理组和40μM DHA预理组Ang2、VEGF、PGE2、PGI2呈剂量依赖性合成减少(P<0.05),且Ang2mRNA和VEGFmRNA相对表达率及COX-2表达水平降低(P<0.05)；与OGD组比较,OGD+10μMDHA+GW9662组和OGD+40μMDHA+GW9662组所有检测指标无差异。Ang2mRNA和VEGFmRNA与PGE2、PGI2分泌量以及COX-2蛋白表达呈正相关(P<0.05)4、与正常对照组比较,OGD、OGD+Ang1、OGD+40μMDHA、OGD+ 40μMDHA+Angl.和OGD+40μMDHA+GW9662+Angl组细胞凋亡明显增力(P< 0.01),Bax、Caspase-3、Tie-1表达明显增加(P<0.01),且Bcl-2、Bcl-2/Bax、Tie-2、 pTie-2、pAkt、Z0-1表达明显降低(P<0.01)；与OGD组比较,OGD+Ang1和OGD+40μMDHA+Ang1组细胞凋亡明显降低(P<0.01)；与正常对照+Ang1组比较,OGD+Ang1和OGD+40μMDHA+Ang1组pTie-2、pAkt、Z0-1明显降低(P<0.01)；与OGD+Ang1组比较,OGD+40μMDHA+Ang1组细胞凋亡明显降低(P<0.01),Bax、Caspase-3、Tie-1表达明显降低(P<0.01),而Bcl-2、Bcl-2/Bax、 Tie-2、pTie-2、pAkt、Z0-1表达明显增加(P<0.01)；与OGD+Ang1组比较,OGD+40μMDHA+Angl+GW9662组所有检测指标无差异(P>0.05)。结论：DHA能够激活过氧化物酶增殖物受体,使血管内皮细胞和星形胶质细胞缺氧环境下Ang2和VEGF表达降低,Ang1表达增加,并减轻细胞凋亡。进一步研究揭示,Ang2和VEGF的分泌下调,与降低COX-2蛋白、PGE2、PGI2表达,经细胞内转录途径调控有关。本研究还发现,DHA预处理后经缺氧环境下培养的胶质细胞上清液,对缺氧环境下脑血管内皮细的具有保护作用,其机制可能与前者Angl分泌水平明显上调,激活Tie2受体相关。最后还发现,DHA预处理可以增强外源性Ang1对缺氧环境下血管内皮细胞的保护作用,其机制与降低Ang2和Tie1表达,恢复Ang1对Tie2受体的正常激活作用相关。