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目的本实验通过构建pPIC9k-his-HPV16E7-IL-28B(Linker)及pPIC9k-IL-7-IL-15(Linker)分泌型重组表达质粒(以下简写为pPIC9k-E7-IL28B、pPIC9k-IL7-IL15),转化毕赤酵母进行诱导表达,从而为研究其对宫颈癌的免疫治疗作用提供新的参考思路和依据奠定基础。方法1.根据毕赤酵母密码子使用频率表,利用OptimumGene软件对基因E7-IL28B进行密码子优化;2.运用分子克隆技术分别构建重组表达质粒载体pPIC9k-E7-IL28B及pPIC9k-IL7-IL15;将重组表达载体pPIC9k-E7-IL28B及pPIC9k-IL7-IL15电转化入P.pastoris GS115中并进行多拷贝转子筛选;3.探索甲醇浓度、诱导温度、诱导时间、培养基pH值等不同条件下融合蛋白pPIC9k-E7-IL28B及pPIC9k-IL7-IL15的表达情况,同时对这两种融合蛋白运用SDS-PAGE进行分析。结果成功构建重组表达质粒载体pPIC9k-E7-IL28B及pPIC9k-IL7-IL15,并通过遗传霉素(G418)筛选到高拷贝转化子;分别将筛选到的高拷贝转化子进行PCR验证,选取PCR阳性、测序正确的菌株进行融合蛋白诱导表达。经过发酵条件优化,分别找出了适合融合蛋白E7-IL28B、IL7-IL15的最佳诱导条件。在甲醇浓度为1%、29℃、230rpm、pH值为6.0、诱导96 h的时候经过基因优化的融合蛋白E7-IL28B得到了表达;在甲醇浓度为1%、29℃、230 rpm、pH值为6.0、诱导120 h的时候融合蛋白IL7-IL15表达量较高。结论1.成功构建毕赤酵母表达载体pPIC9k-HPV16E7-IL-28B及pPIC9k-IL7-IL15,分别将其基因序列整合到毕赤酵母的基因组里;2.密码子优化策略促进了融合蛋白E7-IL28B在毕赤酵母系统中的表达;3.在其它诱导条件相同的情况下,在甲醇浓度为1%的时候融合蛋白IL7-IL15的表达量最高。