【摘 要】
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本文以新疆畜牧科学院生物技术研究所前期研究创制的FGF5基因删除细毛羊FGF5基因编辑绵羊新种质为研究对象,针对稀有品种和珍贵的品种羊的保种问题,开展了FGF5基因编辑绵羊精液携带目的基因的编辑类型与占比,在常规精液冷冻堡附近中添加不同浓度的BSA对FGF5基因编辑绵羊精液进行冷冻保存,并使用FGF5基因编辑绵羊冷冻精液和鲜精进行体外受精制备胚胎,检测胚胎的卵裂率和囊胚率,并对基因编辑胚胎进行分析
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目“OCT4基因在绵羊早期胚胎表达模型的建立及相关作用机制分析”的部分研究成果（项目编号:31760718）；
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本文以新疆畜牧科学院生物技术研究所前期研究创制的FGF5基因删除细毛羊FGF5基因编辑绵羊新种质为研究对象,针对稀有品种和珍贵的品种羊的保种问题,开展了FGF5基因编辑绵羊精液携带目的基因的编辑类型与占比,在常规精液冷冻堡附近中添加不同浓度的BSA对FGF5基因编辑绵羊精液进行冷冻保存,并使用FGF5基因编辑绵羊冷冻精液和鲜精进行体外受精制备胚胎,检测胚胎的卵裂率和囊胚率,并对基因编辑胚胎进行分析,探讨精子的冷冻保存和基因编辑胚胎体外生产可行性,从而长期保存基因编辑绵羊种资资源。为长期保存FGF5基因编辑绵羊种资资源提供理论依据和技术帮助,具有良好的推广价值和经济效益。取得的研究结果如下:（1）成功提取了3只FGF5基因编辑绵羊精子中的DNA,通过Hi-Tom检测技术,详细分析了FGF5基因编辑绵羊精子中各种基因编辑类型和比率。结果显示:1号羊47.90%编辑类型为28bp删除,46.39%为26bp删除,Large＿Indel编辑类型为3.9%,其它编辑类型占1.81%;2号羊58.54%编辑类型为28bp删除,30.89%为WT,其它编辑类型占10.57%;3号羊56.63%编辑类型为C-＞T,34.45%为WT,其它编辑类型占8.92%。（2）通过对FGF5基因编辑绵羊采精前加强补饲和运动,结果显示:FGF5基因编辑绵羊未补饲运动前（63.7%）和补饲运动后（74.5%）精子活率差异显著（P＜0.05）。在常规精液冷冻保护剂中添加不同浓度的牛血清白蛋白,试验结果显示:浓度为0.5%的BSA在精液冷冻-解冻后,精子的活率、活力顶体完整率各项指标能显著高于对照组（0%）和其他浓度（0.2%、1%）（P＜0.05）,精子的畸形率显著低于对照组和实验组（P＜0.05）,筛选出浓度为0.5%的BSA能显著改善解冻后精子的各项指标。（3）分别用FGF5基因编辑绵羊的鲜精和冷冻精液进行体外胚胎生产,研究结果显示:FGF5基因编辑绵羊冷冻精液可以获得较高的卵裂率（90.2%）,与鲜精对照组（90.7%）无显著差异（P＞0.05）;冻精组囊胚率为41.2%,虽然获得了较高的囊胚率,但与鲜精对照组（56.7%）仍有显著差异（P＜0.05）。对FGF5基因编辑绵羊胚胎PCR产物进行sanger测序判读结果为与已知编辑类型一致,通过Hi-Tom检测分析了FGF5基因编辑绵羊胚胎中各种基因编辑类型和比率,结果显示:1号羊45.68%编辑类型为28bp删除,38.87%为26bp删除,Large＿Indel编辑类型为12.71%,其它编辑类型占2.75%;2号羊49.5%编辑类型为28bp删除,36.59%为WT,其它编辑类型占14.36%;3号羊38.89%编辑类型为C-＞T,56.62%为WT,其它编辑类型占4.79%;验证了FGF5基因编辑绵羊的胚胎中均存在已知的FGF5编辑基因类型,且与精子编辑类型占比几乎一致。（4）通过对FGF5基因编辑绵羊胚胎进行免疫荧光染色,结果显示:FGF5基因编辑绵羊囊胚的细胞数正常,胚胎发育过程中Oct4和cdx2关键基因正常表达。通过冷冻精液可以获得正常的FGF5基因编辑绵羊的体外胚胎。
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