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甲状腺干扰物(Thyroid disrupting chemicals,TDCs)是指能够作用于下丘脑-垂体-甲状腺轴或直接作用于甲状腺激素受体(Thyroid Hormones Receptor,TR),影响体内甲状腺激素(Thyroid Hormones,THs)代谢及作用的外源性化合物。PCB153是生物和人体组织中含量最高的PCBs同系物,其含量与机体总PCB负荷具有很好的相关性;p,p’-DDE是DDT在环境和机体内存留时间最持久、浓度最高的代谢产物,是环境中DDT长残留期的标志物。PCBs和p,p’-DDE对人和实验动物甲状腺功能具有明显的干扰作用。 本研究以PCB153和p,p’-DDE作为受试物,以新生期SD大鼠作为研究对象,给予不同低剂量的PCB153和p,p’-DDE,建立大鼠暴露模型;本研究主要观察PCB153和p,p’-DDE单独或联合染毒对大鼠甲状腺生长发育,血清THs的影响,并探讨与THs合成、分泌、代谢密切相关的机制,旨在为进一步研究此类TDCs对甲状腺系统的毒性作用及其机制提供科学依据。 第一部分：PCB153和p,p’-DDE单独及联合染毒对大鼠甲状腺及THs的影响 目的:PCB153和p,p’-DDE单独或联合染毒对大鼠甲状腺及THs的影响。 方法:对新生期的仔鼠从出生后第3天至第15天进行染毒,隔天一次,共7次。按照1ml/kg体重的剂量,经口灌胃进行染毒。PCB153单独暴露实验:溶剂对照组,0.025mg/kgPCB153,0.25mg/kgPCB153,2.5mg/kgPCB153。p,p’-DDE单独及与PCB153联合暴露实验:溶剂对照组,0.1mg/kg,p’-DDE,1mg/kg,p’-DDE,10mg/kgp’-DDE,0.25mg/kgPCB153+1mg/kgp,p’-DDE,2.5mg/kgPCB153+10mg/kgp,p’-DDE。每次染毒前,称取动物体重(哺乳期);染毒结束后,每周称取动物体重一次。所有动物处死后分离甲状腺、大脑、肝等器官,称重后计算脏器系数。采用ELISA试剂盒检测血清中TT4、FT4、TT3、FT3、TSH、TRH。Morris水迷宫定位航行实验、空间探索实验衡量动物空间学习记忆能力。 结果:与对照组相比,2.5mg/kgPCB153组大鼠定位航行实验的潜伏期和总路程明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。在出生后21天时,与对照组相比:0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组甲状腺脏器系数,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比:p,p’-DDE单独及与PCB153联合组甲状腺脏器系数、2.5mg/kgPCB153+10mg/kgp,p’-DDE组肝脏脏器系数升高,差异有统计学意义(P<0.05)。对大鼠出生后21天(PND21)血清甲状腺激素影响:与对照组相比,0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组大鼠血清TT4、FT3、TT3水平、各染毒组TRH水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各暴露组大鼠血清TT4,FT3(除0.1mg/kgp,p-DDE暴露组)明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。在出生后50天时,与对照组相比,各暴露组大鼠血清TT4、TT3、FT4(2.5mg/kgPCB153组)、FT3(0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153)、TSH(0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153)水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各PCB153组大鼠血清TRH水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,大鼠血清TT4(各暴露组)、FT4(10mg/kgp,p-DDE组)水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与PCB153同剂量单独暴露组相比:大鼠血清TT3、FT3水平在0.25mg/kgPCB153+1mg/kgp,p’-DDE、2.5mg/kgPCB153+10mg/kgp,p’-DDE组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。析因分析表明PCB153与p,p’-DDE联合对大鼠(PND50)血清FT3水平影响存在交互作用(F=9.49,P<0.05)。 结论:PCB153、p,p’-DDE单独和/或联合暴露,会对大鼠甲状腺的生长发育产生影响。PCB153、p,p’-DDE单独和/或联合暴露后,大鼠体内甲状腺激素稳态的遭到破坏。PCB153可能会对大鼠的学习、空间记忆能力产生不良影响。 第二部分：PCB153和p,p’-DDE单独及联合染毒甲状腺干扰机制探讨 目的:研究探讨PCB153和p,p’-DDE单独及联合染毒对甲状腺的干扰机制。 方法:采用ELISA试剂盒检测血清中NIS、TG、TPO、TTR、ROS、MDA、GSH-PX、SOD水平。用RealtimeRT-PCR技术检测出生50天后大鼠肝脏组织中TR(TRα1、TRβ1、TRβ2),脱碘酶(D1,D2),肝组织代谢酶(CYP1A1、CYP2B3、UGT1A1、UGT1A9)、甲状腺激素跨膜转运蛋白(MCT8)、视黄醇类X受体(RXRα)、ERK1/2信号通路(Kras1、KRaf1、MEK1、ERK1、ERK2)等基因mRNA表达情况,用Western blot检测出生50天后大鼠肝脏组织中TRβ1、RXRα、总ERK1/2、磷酸化ERK1/2的蛋白表达情况。 结果:21天时,与对照组相比:大鼠血清TPO(各PCB153组)、NIS(0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组)水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。PCB153染毒对大鼠血清TG、TTR水平有性别差异,与对照组同性别相比,雄与雌性大鼠在0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组TG、TTR水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各PCB153染毒组大鼠血清ROS、MDA水平上升,差异有统计学意义(P<0.05);0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组GSH-PX、SOD水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各染毒组大鼠血清ROS(除0.1mg/kgp,p’-DDE暴露组)水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。50天时,与对照组相比,大鼠血清TPO水平在各PCB153组,TG水平在10mg/kgp,p’-DDE组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);PCB153染毒TTR水平影响有性别差异,与对照组同性别相比,雌性大鼠在0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组大鼠血清TTR水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各PCB153暴露组大鼠血清ROS、MDA水平上升,差异有统计学意义(P<0.05);各PCB153暴露组大鼠血清GSH-PX、SOD水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。 与对照组同性别相比:雄性大鼠中,肝脏组织TRα1mRNA表达水平在各PCB153、10mg/kgp,p’-DDE,TRβ1mRNA表达水平在各PCB153(除0.25mg/kgPCB153组)、p,p’-DDE组(除1mg/kgp,p’-DDE组),TRβ2mRNA表达水平在各p,p’-DDE组中及联合组明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);雌性大鼠中,TRα1mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153组、TRβ1mRNA表达水平在10mg/kgp,p’-DDE中,TRβ2mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153,各p,p’-DDE(除1mg/kgp,p’-DDE组)组及联合组明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。析因分析表明,p,p’-DDE与PCB153联合对雄性大鼠(PND50)肝脏组织TRβ1mRNA表达水平的影响存在交互作用(F=10.00,P<0.05)。 与对照组同性别相比,雄性大鼠肝脏组织D1mRNA表达水平在各PCB153组中、p,p’-DDE单独及与PCB153联合组中,D2mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);雌性大鼠肝脏组织,D2mRNA表达水平在0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153、1mg/kgp,p’-DDE、10mg/kgp,p’-DDE、2.5mg/kgPCB153+10mg/kgp,p’-DDE组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。 与对照组同性别相比,雄性大鼠肝脏组织CYP1A1mRNA表达水平在各PCB153组、UGT1A1mRNA表达水平在各PCB153组、各p,p’-DDE单独组,UGT1A9mRNA表达水平在0.025mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组、各p,p’-DDE组中,CYP2B3mRNA表达水平在0.025mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组、各p,p’-DDE单独组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。雌性大鼠肝脏,CYP1A1mRNA表达水平在各p,p’-DDE单独组,UGT1A1mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153组中、UGT1A9mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153、10mg/kgp,p’-DDE组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。析因分析表明,p,p’-DDE与PCB153联合对雄性大鼠(PND50)肝脏组织CYP1A1mRNA表达水平的影响存在交互作用(F=10.28,P<0.05)。 与对照组同性别相比,雄性大鼠肝脏组织MCT8在各PCB153组中、1mg/kgp,p’-DDE、10mg/kgp,p’-DDE组中,RXRαmRNA表达水平在各PCB153组,10mg/kgp,p’-DDE组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);雌性大鼠肝脏组织,MCT8mRNA表达水平在10mg/kgp,p’-DDE组中明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),RXRαmRNA表达水平在各个PCB153组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。 与对照组同性别相比,雄性大鼠肝脏组织Kras1mRNA表达水平在10mg/kgp,p’-DDE组中、Kraf1mRNA表达水平在0.25mg/kgPCB153、10mg/kgp,p’-DDE组,ERK1mRNA表达水平在10mg/kgp,p’-DDE组,ERK2mRNA表达水平在0.1mg/kgp,p’-DDE、10mg/kgp,p’-DDE暴露组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);而MEK1mRNA表达水平在各PCB153暴露组中表达水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),在10mg/kgp,p’-DDE组中表达水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。雌性大鼠肝脏组织Kras1mRNA表达水平在1mg/kgp,p’-DDE组中,Kraf1mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153组,MEK1mRNA表达水平在1mg/kgp,p’-DDE组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。析因分析表明,p,p’-DDE与PCB153联合对雄性大鼠(PND50)肝脏组织Kraf1、Kras1、MEK1mRNA表达水平的影响存在交互作用(F=8.33、6.53、8.19,P<0.05)。 与对照组同性别相比,雄性大鼠肝脏组织总ERK1/2蛋白表达水平在0.025mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153、10mg/kgp,p’-DDE组中,p-ERK1/2蛋白表达水平在2.5mg/kgPCB153、10mg/kgp,p’-DDE组中,TRβ1蛋白表达水平在2.5mg/kgPCB153、10mg/kgp,p’-DDE组中,RXRα蛋白表达水平在0.25mg/kgPCB153+1mg/kgp,p’-DDE蛋白表达水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。雌性大鼠肝脏组织中RXRα蛋白表达水平在2.5mg/kgPCB153+10mg/kgp,p’-DDE组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1)PCB153单独暴露可以抑制TPO、NIS、TG,而p,p’-DDE则对TPO产生抑制作用,对合成THs产生影响。 2)PCB153抑制大鼠体内TTR水平,影响大鼠体内甲状腺激素转运。 3)PCB153和p,p’-DDE能上调雄性大鼠MCT8表达。 4)PCB153和p,p’-DDE能上调脱碘酶和代谢酶的基因表达,干扰THs代谢。 5)PCB153和p,p’-DDE能干扰肝脏TR及核受体RXRα,干扰THs稳态。 6)PCB153和p,p’-DDE能改变机体氧化应激状态,并激活ERK1/2信号通路,调节基因表达。