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前言 宫颈癌是全球妇女中主要死亡原因。在发展中国家中是生育年龄妇女的主要死亡原因。尽管近年宫颈癌的发病率在下降，但宫颈癌的五年生存率却相对较低，而且小于50岁妇女的发病率还增加了10.3％，且以每年3％的速度递增。年轻妇女宫颈上皮内瘤样病变(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)亦成倍增加。因此，寻找宫颈癌早期诊断的基因指标及有效治疗宫颈癌的方法，进一步明确宫颈癌发生、发展的分子生物学机制已成为妇科工作者的当务之急。 近年来对宫颈癌的病因研究及治疗已深入至基因水平，尤其是目前欧美、日本等国家的科学家对环氧合酶COX(Cyclooxygenase,COX)基因的结构、功能及与肿瘤的关系作了大量研究。COX是花生四烯酸转变为前列腺素过程中的关键酶，其诱导型同工酶COX-2被认为与肿瘤的发生密切相关。研究发现在胃癌、前列腺癌、膀胱肿瘤、肺非小细胞癌及腺癌、结直肠癌等多种肿瘤和细胞系中COX-2表达升高。因此认为，COX-2的过高表达与肿瘤的发生、发展密切相关。有关COX-2 mRNA在宫颈癌及CINⅢ组织中的表达情况尚不清楚。本研究应用半定量RT-PCR方法检测宫颈癌及CINⅢ组织中的COX-2 mRNA表达水平，以明确其与宫颈癌发生、发展的关系，为寻找宫颈癌早期基因诊断指标以及基因治疗方法提供依据。 实验材料 一、标本与来源 收集中国医科大学第一、第H临床学院2000年3月一2002年10月手术切除或宫颈活检并经病理学检查证实的70例新鲜组织标本。宫颈癌30例，宫颈CIN皿及原位癌10例，慢性宫颈炎组织30例。标本送于一70t的冰箱中保存待测。 二、方法 1．总RNA提取：采用TRlzol一步抽提法。RNA纯度采用WFH－202型紫外透射仪测定OD值，OD260／280值为1．84一二．90。 2．逆转录合成 CDNA：在 20 gi反应体系中分别加人样本 RNA…l以 90t孵育 3min，42℃30dn合成 cDNA。 3．PCR扩增和产物分析：在PCR反应体系中将CDNA产物及引物在95℃905预变性，94℃905变性，55℃455退火，72℃905复性，进行35个循环后，72℃10min延伸。另一反应体系中同时扩增卜actin作为内对照。将PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，澳乙锭染色分析，紫外灯下拍照，电泳凝胶成像及自动分析系统摄像、并检测各扩增带的产物含量。thX174－Hinc 11 DNAMarker为分子量标准。每次实验均设阳性及空白对照。 4．结果判断上B显色后，与 Marker相比较有 305hP条带及内对照690hp条带显示者判断为阳性，仅有内对照690hp条带显示者判断为阴性。用内对照吸光度值标化COX－2吸光度值，得到COX－2的相对含量，具体计算公式如下：COX－2相对含量 一一（COX一二密度／p－actin）x 100； 5．统计学处理：采用SPSS10．0软件进行统计学处理。实验 ·二·数据用均数。标准差（X。S）表示，两样本均数比较用t检验，两样本率的比较采用 X’检验或 FISher’S精确概率法。 实验结果 一人OX－2 InRNA在宫颈癌、宫颈＊N亚及原位癌和慢性宫颈炎组织中的表达 COX．2 mRNA在宫颈癌中的表达率和相对含量明显高于宫颈CIN皿及原位癌和慢性宫颈炎组织，经比较差异非常显著河＜0．01人 COX－2 mRNA在宫颈QN皿及原位癌和慢性宫颈炎组织中的表达率及相对含量比较均无明显差异（P＞0．05八 二人OX－ZmRNA表达与宫颈癌临床分期、病理分级及淋巴结转移的关系 临床分期1＊＊ll及IV期宫颈癌COX－2 mRNA的表达率和相对含量经比较差异均无显著性h＞0．05人病理分级 1级、11级及皿级宫颈癌中，COX—2 mRNA的表达率和相对含量经比较差异亦无显著性肿＞0．05人有淋巴结转移组其宫颈癌 COX－2mRNA表达率与无淋巴结转移组比较，差异无显著性h＞0．05人有淋巴结转移组其宫颈癌COX—2 mRNA表达的相对含量与无淋巴结转移组比较，差异显著u＜o．05人 讨 论 一人OX－2基因的结构、功能及致癌机制 环氧合酶＊OX）是一种膜结合蛋白，是花生四烯酸转变为前列腺素过程中的关键酶，具有环氧合酶和过氧化物酶双重酶的功能，其诱导型同工酶COX—2被认为与肿瘤的发生密切相关。人COX－2基因长8．3kb，含有10 个外显子，位于染色体l吐5．2－ ·3·q25．3。其转录产物 COX－2 mRNA长4．skb，在有丝分裂原刺激后，COX－2 mRNA水平在30分钟内迅速增加，并在高水平上维持6－8小时，24小时降至基础水平。COX－2在多数细胞及组织中呈低表达，甚至测不出来，但在细胞因子、生长因子、原癌基因。肿瘤启动因子及多种理化因素的作用下，表达可升高10－80倍。通常情况下正常宫颈组织检测不到COX一二的表达，但在EGF诱导下COX－2蛋白表达水平升高并刺激COX－2启动子的活动，说明COX－2在正常宫颈组织中也可诱导性表达。 COX－2基因对肿瘤的作用机制可能为：①抑制细胞凋亡；②