茶麃生柱锈重寄生菌次生代谢产物及对锈孢子作用的研究

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华山松疱锈病是由茶藨生柱锈菌(Cronartium ribicola)引起的一种毁灭性松干锈病,病原的长循环型生活史特征及转主寄主的存在使得该病害的防治尤为困难。目前植物锈病生物防治的重点集中在对锈菌重寄生菌的研究上,但直接采用活体菌防治锈病存在诸多问题,因而重寄生菌——寄主菌互作的分子机制成为研究的热点,目前认为主要包括小分子代谢产物——毒素和胞壁降解酶两类抗性因子,但其分子结构和具体作用机制仍然不清楚,且重寄生菌次生代谢产物未见相关研究报道。针对上述问题,本论文对五株重寄生菌破坏茶藨生柱锈菌锈孢子的两类抗性因子进行了深入研究,并对其中两株重寄生拟盘多毛孢的次生代谢产物进行了分离鉴定和活性测试。主要结果如下:  (1)对四株重寄生菌的毒素进行了研究。从茶麃生柱锈菌的锈孢子堆上分离纯化了三株重寄生拟盘多毛孢,编号cr012、cr013和cr014。它们形态各异,但对茶麃生柱锈菌的锈孢子均有强寄生作用,且对十种常见植物病原真菌具有广谱抗性。活化并复壮了重寄生木霉菌株8662。通过台盼蓝染色法筛选出了四株重寄生菌破坏锈孢子的最佳产毒培养条件,采用活性追踪并结合传统天然产物化学的分离方法,首次从四株重寄生菌中分离得到三种对茶麃生柱锈菌的锈孢子有致死作用的毒素分子,分别为柠檬酸、丁二酸和3-硝基丙酸。三种毒素分子均能使锈孢子细胞膜的通透性发生改变,内含物外溢,台盼蓝染色证实锈孢子死亡。用100μg/mL的柠檬酸处理1小时,茶麃生柱锈菌锈孢子的致死率达到50%,当柠檬酸的浓度达到5mg/mL及其以上时,锈孢子的致死率为100%。分别用4 mg/mL的丁二酸和10μg/mL的3-硝基丙酸处理1小时,锈孢子的致死率达到50%。柠檬酸本身无毒、有效作用浓度较低,且对竹杆锈菌的冬孢子、石楠叶锈菌的锈孢子和三叶草叶锈菌的夏孢子,均有一定的致死作用,具有进一步开发生物农药的潜力。  (2)对两株重寄生拟盘多毛孢的次生代谢产物进行了系统分离纯化、结构鉴定和活性测试。将拟盘多毛孢菌株cr013和cr014分别在改良Fries和改良M-1-D固体培养基中发酵30L,采用正相硅胶柱、反相硅胶柱、葡聚糖凝胶柱(Sephadex)、薄层色谱法、高效液相色谱等技术手段,通过核磁共振(包括1H-和13C-NMR,HMBC,HSQC,COSY,ROESY)、质谱、紫外和红外等波谱学方法及X-晶体衍射等手段,从菌株cr013中分离鉴定了6个新化合物(化合物1-6),其中,化合物1和2为ambuic acid的衍生物,化合物3-6为结构较新颖的聚酮类化合物,聚酮类化合物为拟盘多毛孢属真菌中首次被发现。从菌株cr014中分离鉴定了9个新化合物,均为ambuic acid衍生物(化合物7-15)。抗肿瘤活性筛选结果显示化合物1对供试5种肿瘤细胞HL-60、SMMC-7721、A-549、MCF-7和SW480的IC50值分别为18.99μM、17.68μM、18.28μM、21.67μM和12.27μM,化合物3对上述5种肿瘤细胞的IC50值分别为10.41μM、11.29μM、2.30μM、13.76μM和12.42μM,化合物6对上述5种肿瘤细胞的IC50值分别为15.7μM、31.2μM、10.7μM、23.7μM和21.4μM;化合物4对肺癌细胞A-549有活性,IC50值为10.58μM。抗细菌活性筛选结果显示化合物8、9、13和14对青枯菌(Ralstonia solanacearum)有很强的抑制作用,其MIC值均为0.78μg/mL,与阳性对照头孢噻肟(Cefotaxime)的活性相当。化合物8同时对沙门伤寒菌(Salmonella typhi)具有很强的抑制作用,抑菌活性比头孢噻肟更强。  (3)对重寄生深绿木霉SS003菌株产胞壁降解酶进行了研究。菌株SS003可在茶藨生柱锈菌的锈孢子堆上很好的生长,并在接种5天使锈孢子壁完全碎裂,表明SS003在重寄生过程中可分泌高活性的胞壁降解酶。通过RT-PCR从锈孢子壁诱导72 h的SS003菌丝体中克隆得到1.3 kb全长几丁质酶基因CHI10,通过原核表达和蛋白纯化获得大小约46.0 kD的几丁质酶,该酶在40℃~55℃之间对茶藨生柱锈菌的锈孢子壁具有明显的破坏作用。对已鉴定到种的48株木霉进行接种保湿培养,定期观察木霉菌株在锈孢子堆上的生长情况以及木霉生长对锈孢子造成的影响,结果表明绝大多数木霉菌株都能在锈孢子堆上生长,但生长速度和对锈孢子的影响差异很大,其中,7株深绿木霉对锈孢子壁的破坏作用最强。
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