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研究背景胰腺癌是预后最差的消化道肿瘤之一,这一方面是由胰腺癌高度恶性的生物学行为决定,另一方面也与胰腺癌增殖、转移机制不明确,缺乏有效治疗药物有关。研究表明STUB1蛋白在多种恶性肿瘤中发挥着重要的调控作用,我们前期的研究也证实STUB1可以抑制胰腺癌的增殖与转移等生物学行为。然而STUB1的上游调控机制尚不明确,仅有一篇文章报道在小鼠体内miR-764-5p可以调控STUB1的表达。因此,在胰腺癌中研究micro RNA(miRNAs)调控STUB1的分子机制,将有望加深对胰腺癌发生、发展机制的了解。研究目的探索miR-1178可否在胰腺癌细胞中靶向调节STUB1的表达。研究miR-1178在胰腺癌中的生物学功能。明确miR-1178调控胰腺癌恶性生物学行为的分子机制。检测胰腺癌组织中miR-1178的表达水平,评估其临床价值。研究方法生物信息学方法预测可能调控STUB1的miRNA;双萤光素酶报告基因实验验证STUB1是否是miR-1178的靶基因;实时定量PCR检测miRNA及STUB1 mRNA的表达水平;通过CCK法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力;免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达水平;通过慢病毒载体转染,建立稳转miR-1178的细胞株,在裸鼠体内观察miR-1178对肿瘤生长的影响;采用原位杂交检测胰腺癌组织中miR-1178的表达水平,卡方检验分析miR-1178的表达与临床参数之间的关联性。单因素及多因素生存分析评估miR-1178的预后价值。研究结果1.靶向调控STUB1的miRNA预测及筛选通过生物信息学分析提示 hsa-miR-4716-3p,hsa-miR-1178,hsa-miR-4690-3p,hsa-miR-556-3p可能是STUB1的潜在上游调控分子。双萤光素酶报告基因实验表明:仅在共转染miR-1178mimics和STUB1野生型mRNA载体时,萤光素酶活性显著降低。western blot结果提示:上调miR-1178的表达水平,可以抑制STUB1蛋白的表达,反之,下调miR-1178的表达水平,可以增加STUB1蛋白的表达。2.MiR-1178对胰腺癌细胞恶性表型的调控作用在胰腺癌细胞株PANC-1及BxPC-3中上调miR-1178的表达水平可以显著促进胰腺癌细胞增殖、侵袭、转移以及S期细胞百分比(P<0.05);体内实验发现,稳定过表达miR-1178的胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的体积和重量显著高于对照组(P<0.05)。反之,可以观察到相反的实验结果(P<0.05)。3.MiR-1178调控胰腺癌生物学行为的分子机制在胰腺癌细胞株PANC-1,BxPC-3中过表达miR-1178时,EGFR表达水平增高,AKT的第473位点丝氨酸的磷酸化水平明显增高,而总AKT的表达水平未发生变化,p21蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。当下调miR-1178时,可以观察到相反的结果(P<P<0.05)。过表达miR-1178时,SRC的第416位点酪氨酸的磷酸化水平明显增高,而总SRC的表达水平未发生变化,E-Cadherin蛋白的表达水平明显降低。而下调miR-1178可以观察到相反的结果(P<0.05)。为了验证miR-1178是否通过抑制STUB1表达,激活了增殖和侵袭转移相关的EGFR/AKT/p21与EGFR/SRC/E-cadherin信号通路,我们进一步在过表达miR-1178的PANC-1细胞株中转入了 STUB1基因质粒。发现STUB1可以逆转miR-1178介导的胰腺癌增殖、侵袭和转移,并且抑制PANC-1细胞从G1向S期的转化。进一步进行western blot分析发现,STUB1抑制了 EGFR/AKT/p21及EGFR/SRC/E-cadherin 通路的表达(P<0.05)。4.胰腺癌组织中miR-1178的表达水平与临床病理参数及预后的相关性胰腺癌组织中miR-1178的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。胰腺癌组织中miR-1178表达水平与淋巴结转移呈正相关(P<0.05)。单因素生存分析发现TNM分期、肿瘤分化程度、miR-1178表达水平与患者预后相关。MiR-1178高表达的患者的中位生存时间显著低于miR-1178低表达的患者(P=0.014)。多因素生存分析发现,TNM高分期(Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ)及组织miR-1178高表达水平是胰腺癌患者预后不良的独立危险因素(分别为P=0.049,HR=1.866;P=0.025,HR=2.364)。结论1.MiR-1178可靶向结合于STUB1 mRNA 3’-UTR区域,通过翻译抑制的方式,下调STUB1蛋白的表达。2.MiR-1178可以促进胰腺癌细胞增殖、加速G1/S期转化、促进细胞迁移和侵袭能力,同时可以增加胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长能力。3.MiR-1178促癌功能的分子机制为miR-1178通过靶向抑制STUB1表达,提高了 EGFR的表达,从而激活了其下游的EGFR/AKT/p21以及EGFR/SRC/E-cadherin 信号通路。4.胰腺癌组织中miR-1178表达水平显著高于癌旁组织。胰腺癌miR-1178高表达是患者预后不良的独立危险因素,并且miR-1178表达水平与淋巴结分期呈正相关,提示miR-1178可能成为新的判断胰腺癌患者预后的标志物。