论文部分内容阅读
前言 皮肤挫伤是法医学鉴定中常见的损伤，因此，皮肤挫伤时间的推断成为多年来国内外法医学界研究的热点内容。 最初根据挫伤皮肤颜色的变化推断挫伤时间，但由于人种肤色、年龄等个体差异，无法精确判断皮肤挫伤时间，只能粗略估计。后来通过光学显微镜观察皮肤挫伤后炎症反应中炎性细胞的数量来推断挫伤时间，但由于各种变化的时相互相重叠，给确切推断挫伤时间带来了困难，所以，人们一直在寻找可以相对准确地推断皮肤挫伤时间的方法。随着医学界对创伤后分子病理学认识的提高，创伤后生物物质的变化越来越受到人们的重视，也为法医工作者推断皮肤挫伤时间提供了新的方法。 核转录因子NFκB(nuclear factor kappa B，NFκB)是一种重要的生物因子，调控多种细胞因子如生长因子、细胞因子、粘附分子等编码基因的表达，近来研究表明，NFκB与创伤关系密切。IκBα因其抑制NFκB活性，也越来越受到人们的重视，故本实验应用免疫组织化学方法观察NFκB家族的重要成员NFκB P65与其抑制因子IκBα在大鼠皮肤挫伤后不同时间在多核粒细胞、单核巨噬细胞及成纤维细胞中的表达变化，揭示其与皮肤挫伤时间的关系，为皮肤挫伤时间的判定提供新的理论依据。 材料和方法 1．动物模型制作及分组 健康成年Sprague-Dawley大鼠33只，雌雄不限，体重180±20g，随机分为11组，每组3只，其中10组作为实验组，1组作为对照组。用250g重锤在150cm高度自由落下，造成右后肢股四头肌处皮肤挫伤，分别于挫伤后0h，3h，6h，9h，12h，1d，3d，5d，7d，10d将大鼠脱颈椎处死，于挫伤处取1.5cm×1.5cm皮肤组织。对照组大鼠取与挫伤大鼠相同部位同等大小皮肤组织作为对照。4％多聚甲醛／PBS固定后石蜡包埋，连续5μm厚度切片。 2．实验方法 应用免疫组织化学SABC法，步骤如下: (1)切片脱蜡水化; (2)3%过氧化氢孵育20而n，微波抗原修复(PH6 .0的柠檬酸缓冲液中，微波炉加热至沸腾，间隔smin，连续三次); (3)正常山羊血清孵育，室温下20面n; (4)加人1:200倍稀释的兔抗鼠多克隆NFKB巧5抗体，IKBa抗体，4℃过夜; (5)滴加生物素标记的山羊抗兔I娇抗体，保湿盒内25℃温箱中孵育20min; (6)滴加SABC试剂，保湿盒内25℃温箱中孵育20而n; (7)DAB显色5一10而n，水洗、苏木素复染、透明、中性树胶封片。以上抗体及SABC试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司。 3.统计学分析 采用SPSS for而ndows n .0软件包，应用方差分析进行统计学处理。实验结果 1.NFKB P65与IKBa在挫伤修复过程中的表达变化 正常对照组皮肤中，NFKB P65与IKBa在表皮基底细胞层、棘细胞层、颗粒细胞层和真皮层皮脂腺、汗腺上皮细胞呈阳性表达。实验组标本中，伤后Oh皮肤染色与正常皮肤基本相同;伤后3h组，在浸润的少量多核粒细胞的胞质中NFKB P65与IKBa呈阳性表达;伤后6h一12h，表达增加，伤后ld，在浸润的几乎所有的单核细胞和多核粒细胞的胞质和胞核中NFKB巧5呈强阳性表达，IKBa也在大多数细胞中表达;伤后3d组，成纤维细胞大量增生，阳性细胞主要以成纤维细胞为主;5d一10d组阳性细胞数逐渐减少。 2.阳性细胞计数及统计学分析 2.1 NFKB P65阳性细胞计数:伤后3h，NFKB P65阳性细胞率为(3.20%士0.58%);伤后6h，NFKB P65阳性细胞率开始升高(11.33%士1.53%);gh一12h继续升高，ld达高峰(97.33%土1.53%);伤后3d，阳性细胞率开始下降(79.33%土3.05%);sd一7d继续下降，伤后10d，阳性细胞率下降至(17.67%士2.52%)。 2.2 IKBa阳性细胞计数:伤后3h，IKBa阳性细胞率为(3.33%*0.58%)，伤后6h，IKBa阳性细胞率开始升高(1 1 .00%士1 .00%)，gh一12h继续升高，ld达高峰(84.67%土2.52%);伤后3d，阳性细胞率开始下降(73.00%土2.00%)，sd一7d继续下降，伤后10d，阳性细胞率下降至(13.33%土1 .53%)。 2 .3统计学方差分析:经统计学方差分析，相邻两组阳性细胞率均存在显著差异(P<0.01)，且各组与1d组相比阳性细胞率均存在显著差异(P<0 .01)。讨论 核转录因子NFKB(nuelear factor kappaB，NFKB)是1986年由Sen和Baltimere首先从B淋巴细胞抽提物中检测到的一种能与免疫球蛋白k链基因增强子B位点结合，调控免疫球蛋白k链基因转录的核蛋白因子。细胞未受到刺激时，细胞中的NFKB处于未活化状态，不具有调节基因转录的功能，此时，NFKB成员通常以同源二聚体或异源二聚体形式与其抑制蛋白IKB结合形成三聚体复合物，以非活性形式存在于细胞质中。当细胞受到病毒、放射线、氧自由基、细胞因子如TNFa、IL一1等细胞外因素刺激时，NFKB从NFKB一IKB复合物中解离出来，并迅速移位至细胞核，从而发挥转录调节功能。越来越多的研究表明，NFKB在炎症反应、免疫应答中起重要作用。 NFKB P65是NFKB家族中最为重要的成员，而IKBa是NFKB的主要抑制蛋白之一。本实验应用免疫组织化学技术观察到在皮肤挫伤修复过程中NFKB P65与 IKBa在皮肤挫伤区及周边区?