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第一部分人视网膜色素上皮细胞光损伤模型的建立及丝氨酸蛋白酶HtrAl的表达研究目的:构建蓝光损伤的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)ARPE-19细胞体外模型,在此基础上观察丝氨酸蛋白酶HtrAl在光损伤模型中的表达情况。方法:体外培养人视网膜色素上皮ARPE-19细胞,取第8-12代生长良好的传代细胞用于实验。将细胞分为正常对照组、光损伤模型组。采用波长400nm的蓝色节能灯以(2000±500)Lux持续光照人ARPE-19细胞6h建立光损伤模型。显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测构建模型细胞凋亡情况。实时聚合酶链反应(Real-Time PCR)和蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测12h,24h,48h及72h不同时间点光损伤模型细胞HtrAlmRNA和蛋白表达变化情况。建模后光损伤模型组再分为针对HtrAl的小干扰RNA(HtrAl siRNA)组、阴性对照组、空白对照组。应用Lipofectamine2000将HtrAl siRNA转染至HtrAl siRNA组细胞;阴性对照组细胞转染非特异的阴性siRNA(control siRNA);空白对照组为单纯光损伤模型细胞。采用Real-Time PCR和 Western blot检测siRNA干扰效率。结果:显微镜下观察光损伤模型组部分细胞边界及细胞核边界不清,色素颗粒增多,出现损伤性的变化;流式结果显示光损伤模型组凋亡率较正常细胞组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。Real-Time PCR结果显示光损伤模型组细胞mRNA表达量在12h、24h、48h、72h各个时间点均较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,24h、48h、72h光损伤模型组HtrAl蛋白表达量较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组HtrAl mRNA和蛋白的表达量随着时间无明显变化。小干扰RNA技术干扰后,Real-Time PCR和Western blot结果显示HtrAl siRNA组HtrAl mRNA表达量和蛋白表达量显著小于正常对照、阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。结论:蓝光照射可引起人ARPE-19细胞损伤性变化、凋亡增加,该体外模型可用于年龄相关性黄斑变性研究的模型。在光损伤模型组人ARPE-19细胞中,HtrAl表达随着时间逐渐增加表达增加,提示HtrA1可能参与了其中的损伤变化过程;HtrAl siRNA能有效的沉默HtrAl基因表达。第二部分siRNA介导丝氨酸蛋白酶HtrAl沉默对光损伤模型人视网膜色素上皮细胞增殖、迁徙以及凋亡的影响目的:观察siRNA介导丝氨酸蛋白酶HtrAl沉默对光损伤模型人RPE细胞生长、迁徙以及凋亡的影响,并探讨可能参与凋亡的相关因子的表达情况。方法:采用波长400nm的蓝色节能灯以(2000±500)Lux持续光照人ARPE-19细胞6h建立光损伤模型。用脂质体Lipofectamine 2000将HtrA siRNA转染光损伤模型细胞建立HtrAl siRNA组,转染control siRNA为阴性对照组,单纯光损伤细胞为空白对照组。正常细胞为正常对照组。CCK-8、transwell小室法及流式细胞仪分别检测细胞增殖、迁徙以及凋亡、细胞周期情况;Real-Time PCR和Western blot检测相关凋亡蛋白Bax、Caspase-3以及Bcl-2的表达情况。结果:与阴性对照组、空白对照组比较,HtrA1 siRNA组细胞增殖及迁徙能力明显下降(P<0.05);HtrAl siRNA组细胞的凋亡率较阴性对照组、空白对照组明显下降,停留在G0/G1期数目增多,差异有统计学意义(P<0.05);HtrAlsiRNA组Bax及Caspase-3的mRNA和蛋白表达较阴性对照组、空白对照组均明显降低,而Bcl-2的mRNA和蛋白表达均明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论特异性沉默HtrAl基因的表达可以降低蓝光损伤的人RPE细胞增殖、迁徙能力以及凋亡,使细胞停留在G0/G1期数目增多;同时通过下调Bax、Caspase-3以及上调Bcl-2的表达来降低蓝光引起的细胞凋亡。第三部分下调丝氨酸蛋白酶HtrAl表达对光损伤模型人RPE细胞血管内皮生长因子A影响及其机制研究目的:观察siRNA介导丝氨酸蛋白酶HtrAl沉默对光损伤模型人RPE细胞血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)影响,并探讨其可能机制。方法:采用波长400nm的蓝色节能灯以(2000±500)Lux持续光照人ARPE-19细胞6h建立光损伤模型。用脂质体Lipofectamine 2000将HtrA siRNA转染光损伤模型细胞建立HtrAl siRNA组,转染control siRNA为阴性对照组,单纯光损伤细胞为空白对照组,正常细胞为正常对照组。Real-Time PCR和Western blot检测各组HtrAl、VEGF-A以及NF-κB的mRNA和蛋白表达情况。结果:HtrAl siRNA组细胞HtrAl、VEGF-A以及NF-κB mRNA相对表达量较阴性对照组、空白对照组均有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);HtrA1 siRNA组细胞HtrAl、VEGF-A以及NF-κB蛋白相对表达量较阴性对照组、空白对照组均有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组、空白对照组与正常对照组比较,HtrAl、VEGF-A以及NF-κB表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:光损伤模型中,HtrAl、VEGF-A以及NF-κB在光损伤后呈现出同向的增长趋势;下调HtrAl表达后,转录因子NF-κB以及VEGF-A表达下降。提示这几个细胞因子之间可能存在一定的联系,参与了光损伤的病理生理过程。