梗阻性黄疸会对肾脏造成损害,进而增加梗阻性黄疸患者围术期风险。血管紧张素转化酶2(ACE2)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的新发现因子,在肾脏中表现为保护作用,明确ACE2对梗阻性黄疸患者肾功能改变的作用有助于找到更多的改善梗阻性黄疸患者围术期肾功能的途径。研究通过胆管结扎建立梗阻性黄疸大鼠模型,进行如下内容的研究:(1)观察梗阻性黄疸大鼠肾脏的病理学变化以及肾脏ACE2 mRNA水平及胆红素、肌酐的变化,并分析其相关性。(2)通过ACE2激活剂、抑制剂对梗阻性黄疸大鼠模型干预,观察其肾脏功能变化,探讨ACE2表达改变对梗阻性黄疸肾功能的影响程度。(3)通过螺内酯对梗阻性黄疸大鼠模型干预,观察梗阻性黄疸大鼠RAAS组分中肾素、ACE2、AngⅡ、Ang-(1-7)、醛固酮的的变化以及I-CAM1的变化。探讨螺内酯是否能对梗阻性黄疸大鼠RAAS组分及对肾功能产生影响,以及这些影响与肾脏纤维化之间可能的关系。一、血管紧张素酶2(ACE2)在黄疸大鼠肾脏中的表达目的:通过胆管结扎建立梗阻性黄疸大鼠模型,观察肾脏变化,测定胆红素、肌酐、ACE2 mRNA水平并分析之间的关系。方法:采用胆管结扎建立梗阻性黄疸大鼠模型,56只雄性SD大鼠随机分为2组:假手术组(sham operation,SO,n=28)和胆总管结扎组(bile duct ligation,BDL,n=28)。于术后3天、7天、10天、14天分别取两组大鼠血液、肾脏。观察大鼠一般情况,留取血液标本行胆红素、肌酐测定。采用荧光定量PCR方法检测不同时间点不同肾脏样本的ACE2 mRNA水平。肾脏组织免疫组化观察ACE2表达情况。通过线性相关分析进行ACE2 mRNA水平与胆红素、肌酐变化的相关性。结果:(1)一般情况:实验大鼠实验过程无死亡。胆总管结扎2天后,大鼠尿液颜色开始变黄。3-4天时全身肤色开始变黄,食欲逐渐下降。术后7天开腹可见近脏胆总管残端呈囊状扩张。肝脏弥漫性肿大,质地变硬呈深黄褐色。肾脏大体可见随胆总管结扎时间的延长,颜色逐渐加深。(2)与SO组比较,3天、7天、10天与14天BDL组TBil显著增高,(P<0.05)其中14天的BDL组上升最高;与3天BDL组比较,7天、10天与14天BDL组TBil显著增高,(P<0.05)。与SO组比较,3天、7天、10天与14天BDL组Scr显著增高,(P<0.05),其中14天的BDL组上升最高;与3天BDL组比较,10天与14天BDL组Scr显著增高,(P<0.05)。(3)与SO组相比较,14天BDL组的ACE2 mRNA水平显著降低,(P<0.05),两组间第3天(p=0.84)、第7天(p=0.27)、第10天(p=0.06)无明显差异。(4)通过线性相关分析,ACE2 mRNA水平变化与TBil变化两者呈负相关,(P<0.01),相关系数r=-0.516;ACE2 mRNA水平变化与Scr变化两者呈负相关,(P<0.01),r=-0.576。(5)ACE2免疫组化结果显示,ACE2抗体主要在肾脏的肾小管表达,BDL组中随着胆管结扎天数的延长,肾小管内ACE2抗体强阳性表达比例逐步减少。结论:随着胆管结扎时间延长梗阻性黄疸大鼠胆红素、肌酐升高,而ACE2 mRNA水平呈下降趋势。提示肾脏ACE2 mRNA水平下降与梗阻性黄疸大鼠肾功能改变水平具有相关性。二、ACE2激动、抑制对梗阻性黄疸大鼠肾脏功能的影响目的:观察ACE2活性改变是否对梗阻性黄疸大鼠的肾功能存在影响以及可能的机制。方法:受试大鼠随机分为4组:假手术组(SO,n=14),假手术术后第3天至处死前一天给予腹腔注射生理盐水100μl/d;胆总管结扎组(BDL,n=14),胆总管结扎术后第3天至处死前一天给予腹腔注射生理盐水100μl/d;胆总管结扎激动干预组(BDL+D,n=14)给予DIZE 15mg/kg干预;胆总管结扎ACE2抑制干预组(BDL+M,n=14)给予MLN-4760 10mg/kg干预。于结扎第7天、14天处死后留取肾组织、血液备检。肾组织ACE2、肾素、AngII、Ang-(1-7)、醛固酮采用ELISA法测定浓度。肾脏组织HE染色后观察组织病理改变。组间差异进行多因素方差分析。结果:(1)与SO组相比较,7天,14天BDL组、BDL+D组和BDL+M组TBil有显著差异(P<0.05),提示胆管结扎后大鼠胆红素明显升高;与7天BDL组相比较14dBDL组TBil有显著差异(P<0.05);与7天BDL+D组相比较14dBDL+D组TBil有显著差异(P<0.05);与7天BDL+M组相比较14dBDL+M组TBil有显著差异(P<0.05);提示随时间延长,胆管结扎大鼠胆红素升高。(2)Scr与7天SO组相比较,7天BDL组和BDL+M组Scr升高有显著差异(P<0.05),与14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+D组和BDL+M组Scr升高有显著差异(P<0.05),提示胆管结扎后大鼠肌酐明显升高;与7天BDL组相比较,7天BDL+D组Scr显著下降,BDL+M组Scr显著上升(P<0.05),与14天BDL组相比较,14天BDL+D组Scr显著下降,BDL+M组Scr显著上升(P<0.05)。(3)ACE2、肾素、AngII、醛固酮与Ang-(1-7)含量变化:在肾脏组织中,与7天SO组相比较,7天BDL组、BDL+D组和BDL+M组ACE2表达无明显变化(P=0.268,P=0.161,P=0.172);与14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+D组和BDL+M组ACE2表达明显下调(P<0.05);与7天BDL组相比较,7天BDL+D组和BDL+M组组间ACE2无明显变化(P=0.765,P=0.794),与14天BDL组相比较,14天BDL+D组和BDL+M组组间ACE2无明显变化(P=0.921,P=0.832)。提示ACE2抑制剂MLN-4760与ACE2激活剂DIZE不会对ACE2表达量造成影响。与7天SO组相比较,7天BDL组、BDL+D组和BDL+M组肾素表达明显升高(P<0.05);与14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+D组和BDL+M组肾素表达明显升高(P<0.05);与7天BDL组相比较,7天BDL+D组和BDL+M组肾素变化不明显(P=0.475,P=0.103);与14天BDL组相比较,14天BDL+D组和BDL+M组组间肾素无明显变化(P=0.173,P=0.335);与7天BDL组相比较,14天BDL组肾素表达明显升高(P<0.05);与7天BDL+D组相比较,14天BDL+D组肾素表达明显升高(P<0.05);与7天BDL+M组相比较,14天BDL+M组肾素表达明显升高(P<0.05)。与7天SO组相比较,7天BDL组、BDL+D组和BDL+M组AngⅡ表达明显升高(P<0.05);14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+D组和BDL+M组AngⅡ表达明显升高(P<0.05);与7天BDL组相比较,7天BDL+D组和BDL+M组变化差异显著(P<0.05);与14天BDL组相比较,14天BDL+D组和BDL+M组组间变化差异显著(P<0.05);与7天BDL组相比较,14天BDL组AngⅡ表达明显升高(P<0.05);与7天BDL+D组相比较,14天BDL+D组AngⅡ表达明显升高(P<0.05);与7天BDL+M组相比较,14天BDL+M组AngⅡ表达明显升高(P<0.05)。与7天SO组相比较,7天BDL组、BDL+D组和BDL+M组Ang-(1-7)表达明显降低(P<0.05);与14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+D组和BDL+M组Ang-(1-7)表达明显降低(P<0.05);与7天BDL组相比较,7天BDL+D组和BDL+M组Ang-(1-7)变化差异显著(P<0.05);与14天BDL组相比较,14天BDL+D组和BDL+M组组间Ang-(1-7)变化差异显著(P<0.05);与7天BDL组相比较,14天BDL组Ang-(1-7)表达明显降低(P<0.05);与7天BDL+D组相比较,14天BDL+D组Ang-(1-7)表达明显降低(P<0.05);与7天BDL+M组相比较,14天BDL+M组Ang-(1-7)表达明显降低(P<0.05)。与7天SO组相比较,7天BDL组、BDL+D组和BDL+M组醛固酮表达明显上调(P<0.05);与14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+D组和BDL+M组醛固酮表达明显上调(P<0.05);与7天BDL组相比较,7天BDL+D组和BDL+M组醛固酮差异显著(P<0.05);与14天BDL组相比较,14天BDL+D组和BDL+M组组间醛固酮变化差异显著(P<0.05);与7天BDL组相比较,14天BDL组醛固酮表达明显上调(P<0.05);与7天BDL+D组相比较,14天BDL+D组醛固酮表达明显上调(P<0.05);与7天BDL+M组相比较,14天BDL+M组醛固酮表达明显上调(P<0.05)。HE染色结果显示BDL组(14d)较BDL组(7d)损害加剧;同一时间点内,BDL+M组损害最明显,BDL+D组损害较SO组明显。结论:通过ACE2激活,可以减轻梗阻性黄疸大鼠肾脏损伤但随着梗阻性黄疸时间的延长,其效应有下降的趋势,而ACE2抑制剂则能够加剧此种损伤。提示ACE2可能参与了梗阻性黄疸大鼠肾功能损害过程,表现为一种保护性因素。ACE2活性改变后AngII、Ang-(1-7)、醛固酮也发生变化。三、螺内酯对黄疸大鼠ACE2表达及肾脏功能损害的影响目的:本研究希望通过胆管结扎建立梗阻性黄疸大鼠模型给予醛固酮受体拮抗剂(螺内酯)干预后,测定肾脏ACE2、肾素、AngⅡ、Ang-(1-7)、醛固酮、I-CAM1水平,及其与肌酐变化间关系,初步评价螺内酯对黄疸大鼠肾脏及局部RAAS组分特别是ACE2表达的影响,以及这些影响与肾脏纤维化之间可能的关系。方法:42只SD大鼠随机分为3组:假手术组(sham operation,SO,n=14)、胆总管结扎组(bile duct ligation,BDL,n=14)和胆总管结扎螺内酯干预组(BDL+S组,n=14)。SD大鼠按照第一部分方法进行胆总管结扎,螺内酯干预在结扎后第三天开始给予大鼠螺内酯(40mg/kg/d)直到处死前。结扎后7d、14d留取肾组织、血液备检。检测血浆胆红素、肌酐变化情况。采用ELISA法进行SD大鼠肾组织ACE2、肾素、AngII、Ang1-7、醛固酮、I-CAM1指标的检测。肾脏组织HE染色、Masson染色后观察组织病理改变。肾脏组织I-CAM1免疫组化,观察变化。结果:随着结扎时间延长,SD大鼠血清胆红素持续上升,随之肌酐上升,而螺内酯干预与否不会明显影响胆红素及肌酐变化。在肾脏组织中观察到,(1)ACE2表达:与7天SO组相比较,7天BDL组ACE2表达下调量有显著差异(P<0.05)、BDL+S组ACE2表达差异不明显(P=0.074);与14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+S组ACE2表达下调,差异显著(P<0.05);与7天BDL组相比较,7天BDL+S组ACE2上调差异显著(P<0.05);与14天BDL组相比较,14天BDL+S组ACE2上调差异显著(P<0.05);(2)肾素表达:与7天SO组相比较,7天BDL组和BDL+S组肾素表达上调,差异显著(P<0.05);与14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+S组肾素表达上调,差异显著(P<0.05);与7天BDL组相比较,7天BDL+S组肾素差异不显著(P=0.665);与14天BDL组相比较,14天BDL+S组肾素上调差异显著(P<0.05)(3)AngII表达:与7天SO组相比较,7天BDL组和BDL+S组AngII表达上调,差异显著(P<0.05);与14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+S组AngII表达上调,差异显著(P<0.05);与7天BDL组相比较,7天BDL+S组AngII差异不显著(P=0.151);与14天BDL组相比较,14天BDL+S组AngII下降差异显著(P<0.05)(4)Ang-(1-7)表达:与7天SO组相比较,7天BDL组和BDL+S组Ang-(1-7)表达下调,差异显著(P<0.05);与14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+S组Ang-(1-7)表达下调,差异显著(P<0.05);与7天BDL组相比较,7天BDL+S组AngII表达增加显著(P=0.032<0.05);与14天BDL组相比较,14天BDL+S组AngII表达增加差异显著(P=0.018<0.05)(5)醛固酮表达:与7天SO组相比较,7天BDL组和BDL+S组醛固酮表达上调,差异显著(P<0.05);与14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+S组醛固酮表达上调,差异显著(P<0.05);与7天BDL组相比较,7天BDL+S组醛固酮表达上调降低,差异显著(P<0.05);与14天BDL组相比较,14天BDL+S组醛固酮表达上调降低,差异显著(P<0.05);I-CAM1表达:与7天SO组相比较,7天BDL组和BDL+S组I-CAM1表达上调,差异显著(P<0.05);与14天SO组相比较,14天BDL组、BDL+S组I-CAM1表达上调,差异显著(P<0.05);与7天BDL组相比较,7天BDL+S组I-CAM1表达降低,差异显著(P<0.05);与14天BDL组相比较,14天BDL+S组I-CAM1表达降低,差异显著(P<0.05);提示胆管结扎大鼠模型肾脏I-CAM1表达增加,而螺内酯干预可以使胆管结扎大鼠肾脏表达增加的I-CAM1降低。HE染色结果显示BDL组(7d):细胞水肿且形态异常,伴随炎性细胞侵润;BDL+S组(7d):有炎性细胞侵润,细胞形态异常,水肿现象得以缓解;BDL组(14d):有炎性细胞侵润,细胞形态异常,管腔内可见管型或坏死脱落的细胞,损伤较严重;BDL+S组(14d):损伤程度较轻于BDL组(14d),很少见管型和坏死细胞,但细胞形态仍然异常,仍有炎性细胞侵润。在Masson染色结果中观察到,SO组中仅有少量染成蓝色的胶原纤维,而在BDL组胶原纤维增加,且随结扎时间的延长而加重;而同一时间点上BDL+S组较BDL组胶原合成有所降低,但较SO组仍存在增加。结论:胆管结扎大鼠随结扎时间延长,肾功能恶化,RAAS组分中肾素、AngII、醛固酮均表达上升,而ACE2、Ang-(1-7)则表现为表达下调,肾脏的炎症及纤维化程度均增加,上述改变可能是梗阻性黄疸造成肾功能改变的原因之一。而螺内酯可以逆转上述表现,但随着时间的延长,作用效果逐渐减弱。