猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)是瑞典研究人员于2009年在患病猪中检测到的,常在发生仔猪多系统衰竭综合征、腹泻和呼吸道疾病的猪群中检出,国内外研究表明PBoV在患病猪群和健康猪群中均存在。目前对于PBo V致病性仍然存在争议,推测该病毒致病性较弱,需要与其他病毒协同发挥致病作用。临床上与其他病毒存在双重和多重感染,尤其与猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)感染检出率高,我们推测PCV2可能在该病毒致病过程中起着重要作用。本研究选择猪博卡病毒VP1的优势抗原表位进行基因克隆和原核表达,利用重组蛋白初步建立间接ELISA抗体检测方法。同时通过PBoV单独感染及与PCV2混合感染猪肠上皮细胞(IPEC-J2),初步探讨该病毒对IPEC-J2的感染能力,以及PCV2对PBoV感染的协同作用。具体研究主要有以下两部分:1.猪博卡病毒间接ELISA抗体检测方法的初步建立扩增猪博卡病毒NP08株部分VP1基因,构建重组表达质粒pET-tVP1,原核表达获得大小为56.7kDa的重组蛋白。用重组VP1蛋白作为包被抗原,初步建立PBoV的间接ELISA抗体检测方法。与Western blot结果符合率在81.25%,批内和批间重复试验变异系数均小于10%。应用本方法对12个场832份猪血清进行检测,PBoV抗体阳性率25.6%,其中腹泻猪群抗体阳性率32.65%(207/634),健康猪群抗体阳性率3.03%(6/198)。2.PBoV与PCV2共感染对细胞影响的研究(1)将PBoV、PCV2单独或混合接种猪肾细胞(PK-15),发现空白对照组、PCV2组细胞无病变,PBoV感染组及混合感染组出现不同程度堆积、脱落等细胞病变,且混合感染组比单独感染组细胞病变明显。然而,Real-time PCR检测发现PCV2并不能促进PBoV在PK-15细胞上增殖,且与感染先后顺序无关。(2)将PBoV、PCV2单独或混合接种IPEC-J2,HE染色发现感染组细胞有脱落现象,细胞病变主要发生在细胞质中,细胞质降解变稀薄、有空洞现象。病毒感染24h后收集细胞,PBoV和PCV2单独感染细胞凋亡率分别为6.70%和6.29%,而PBoV和PCV2同时感染细胞凋亡率为10.8%,明显高于单独感染组。Real-time PCR检测发现PCV2并不能促进PBoV在IPEC-J2细胞上增殖,且与感染先后顺序无关;PBoV也不能促进PCV2在IPEC-J2细胞上增殖。混合感染后四种炎性因子(IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α)在转录和翻译水平上均比单独感染后有极显著上调(P<0.001);对IPEC-J2跨膜上皮电阻值测定:感染组在1h时TEER值极速下降后上升,在12h时又下降,12-84h期间TEER趋于平稳;进一步研究发现感染组OCLN、CLDN1、ZO-1表达显著下调(P<0.01),主要发生在细胞感染早期。总之,本研究首次探讨了PCV2对PBoV在细胞水平增殖和致病性的影响,发现混合感染组比单独感染组细胞病变严重。PCV2不能促进PBoV增殖,但可以促进感染细胞炎性因子表达,对细胞屏障破坏更严重。为进一步探讨PBoV感染及致病机理提供了依据。