[目的]N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）参与小脑皮质神经环路的重要生理及病理过程,如突触可塑性、运动学习和记忆、神经病变以及小脑性运动障碍。小脑皮层通过苔藓纤维（MF）-颗粒细胞（GrC）和攀爬纤维（CF）两条通路接收来自外界的各种感觉输入,并由浦肯野细胞（PC）产生与运动相关的指令输出,参与感觉、知觉、运动协调、运动学习与自主运动的精细调节。小脑颗粒层主要包括两种神经元,GrC和高尔基细胞。GrC是小脑皮质的中继神经元,也是唯一的兴奋性神经元,接收来自MF的兴奋性输入,并通过平行纤维将传入信息传递给PC和分子层中间神经元（MLI）。在小脑皮质中,NMDAR在小脑的GrC中大量表达,并参与小脑皮质苔藓纤维-颗粒细胞（MF-GrC）的突触传递,提示NMDAR可能在小脑皮质MF-GrC功能活动和运动协调中起重要作用,但其作用机制尚不清楚。因此,本研究利用在体电生理记录、免疫组化、药理学、小脑皮层微量注射和行为学等技术手段,研究了NMDAR在乌拉坦麻醉小鼠面部刺激诱发的MF-GrC突触传递中的作用机制;探讨其在运动协调中的作用;探究其在面部吹风刺激诱发的MF-GrC长时程可塑性中的影响。本研究旨在阐明NMDAR对感觉刺激诱发的小脑皮质MF-GrC的突触传递及长时程可塑性的影响机制,明确其在运动协调中的作用。[方法]（1）动物准备。使用乌拉坦（1.3 g/kg体重）腹腔注射麻醉成年（6-8周龄）小鼠。在小脑Crus I/II区钻取1-1.5 mm小孔,暴露小脑表面。用含氧的人工脑脊液（ACSF）以0.5 ml/min的速度持续的灌流脑表面。使用体温仪监测并维持直肠温度在37±0.2°C。（2）电生理记录。应用Axopatch-200B放大器对小脑GrC进行细胞外记录。利用Clampex10.4软件,通过Digidata 1440数模转换器采集MF-GrC突触活动信号。记录电极填充ACSF,电阻3-5 MΩ。通过微操作器将玻璃电极缓慢刺入软脑膜下约300-400μm,到达颗粒层,在电流钳模式下,记录感觉刺激诱发的颗粒层场电位反应。使用GABAA受体阻断剂picrotoxin来消除Golgi细胞的抑制性成分,进而分离与记录感觉刺激诱发的MF-GrC兴奋性突触传递成分。（3）感觉刺激。应用刺激持续时间10 ms,刺激压力60 psi的吹风刺激来研究感觉刺激诱发MF-GrC突触传递的影响;应用配对吹风刺激,作为突触可塑性诱导的测试刺激;应用10 ms,20 Hz,240个脉冲的串刺激来诱导MF-GrC突触长时程可塑性的发生,进而研究NMDAR在MF-GrC突触传递长时程可塑性中的作用。所有药物溶解于ACSF中,并通过蠕动泵以0.5 ml/min的速度将药液直接应用于小脑表面。（4）免疫组织化学和成像。小鼠经腹腔注射7%水合氯醛（5 ml/kg）深度麻醉,然后经心灌注300 ml p H值为7.4的冷磷酸盐缓冲液（PBS）,再灌注300ml 4%多聚甲醛PBS溶液。在4°C条件下,将大脑固定48 h,用刀片把小脑和大脑分开。将小脑包埋后,用冷冻切片机切成厚度为8μm的切片,并保存于4°C进行免疫组化实验。分别在兔抗GluN2A、Alexa Fluor 555驴抗兔和4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）中培养。荧光图像通过共聚焦激光扫描显微镜获得。在尼康C2激光共聚焦系统上,用10倍物镜获得了包含所需区域（Crus II）的大区域图像。（5）小脑皮层微量注射与运动行为学检测。小脑皮层Crus I/II区微量注射:取4-5周龄小鼠在10%的水合氯醛麻醉下,应用脑立体定位实施外科手术,将制备好的注射用套管植入小鼠小脑的Crus I/II区,术后涂抹抗菌软膏、腹腔注射抗生素,恢复7天。动物分对照组和给药组,于术后第8天上午9点利用微量注射泵向小脑皮层表面分别微量注射100 nl的ACSF（对照组）或受体阻断剂（给药组）,随后进行行走障碍分析和转棒运动测试。（6）电生理数据用Clampfit 10.4软件分析。数值表示为平均值±标准误。使用SPSS软件进行单因素方差分析和双因素方差分析,确定各组数据之间的统计显著性差异水平。低于0.05的P值被认为实验组之间存在统计上的显著差异。[结果]第一部分:NMDAR对MF-GrC感觉信息突触传递和运动协调的影响机制（1）在GABAA受体拮抗剂picrotoxin存在情况下,可以记录到面部吹风刺激诱发小鼠小脑皮层MF-GrC的突触传递。（2）激活NMDAR显著增强感觉刺激诱发小鼠小脑皮层MF-GrC的突触传递,而阻断NMDAR显著减弱感觉刺激诱发的MF-GrC的突触传递。提示NMDAR的激活参与小鼠小脑皮层颗粒层的感觉信息处理。（3）阻断含有GluN2A亚基的NMDAR可显著减弱感觉刺激诱发的小脑颗粒层的MF-GrC突触传递,并完全阻断NMDA对MF-GrC突触传递的增强作用。但阻断含有GluN2B亚基和GluN2C/D亚基的NMDAR不影响感觉刺激诱发的小脑颗粒层的MF-GrC突触传递,并不影响NMDA对MF-GrC突触传递的增强作用。结果提示含有GluN2A亚基,而不是含有GluN2B亚基和GluN2C/D亚基的NMDAR参与小鼠小脑颗粒层的感觉信息传递。（4）应用含有GluN2A亚基NMDAR的正性调节剂GNE-0723显著增强MF-GrC的突触传递,而给予含有GluN2A亚基的NMDAR阻断剂,不仅减弱了MF-GrC突触传递,并且完全阻断GNE对MF-GrC的增强作用。该结果进一步提示NMDA通过含有GluN2A亚基的NMDAR来增强面部感觉刺激诱发的小鼠小脑皮层MF-GrC突触传递。（5）在小脑微量注射D-APV或者PEAQX,阻断小脑皮层Crus II区的NMDAR或含有GluN2A亚基的NMDAR可以导致小鼠在行走障碍中错步次数和错步时间显著增加,在转棒实验中从转棒上掉落的潜伏期和转速大幅降低,表明阻断小脑皮层Crus II区的NMDAR或含有GluN2A亚基的NMDAR损伤小鼠行走运动协调能力。第二部分:NMDAR在感觉刺激诱发MF-GrC长时程可塑性中的作用机制（1）在阻断GABAA受体条件下,20 Hz面部刺激可以诱导的小脑颗粒层MF-GrC产生LTP,但阻断NMDAR,导致20 Hz面部刺激不能诱导的小脑颗粒层MF-GrC产生LTP。表明面部刺激诱导的小脑MF-GrC的LTP是由含有GluN2A亚基的NMDAR介导的。（2）在阻断含有GluN2A亚基的NMDAR条件下,20 Hz面部刺激不能诱导小脑颗粒层产生MF-GrC LTP。但阻断含有GluN2B以及GluN2C/D亚基的NMDAR对20 Hz面部刺激诱导的小脑颗粒层MF-GrC LTP没有影响。此外,激活含有GluN2A亚基的NMDAR可以诱导MF-GrC LTP,并导致感觉刺激不能进一步诱发MF-GrC LTP。上述结果表明:MF-GrC LTP的诱导需要PKA和PKC信号通路介导,也需要细胞内钙离子浓度的参与。（3）应用一氧化氮合酶（NOS）抑制剂可消除面部刺激诱导的小鼠小脑皮质MF-GrC LTP。而应用NO供体SNAP不仅可以诱导产生MF-GrC LTP,并可阻断20 Hz刺激进一步诱导MF-GrC LTP。（4）20 Hz面部吹风刺激诱发小脑颗粒层MF-GrC LTP的细胞内信号机制。无论是抑制蛋白激酶A（PKA）还是阻断PKC信号通路均可导致使面部刺激无法诱导小鼠小脑皮质产生MF-GrC LTP。此外,耗竭细胞内Ca2+,导致面部刺激不能诱导小鼠小脑皮质产生MF-GrC LTP。上述结果表明:MF-GrC LTP的诱导需要PKA和PKC信号通路介导,也需要细胞内钙离子浓度的参与。（5）免疫组织化学实验结果显示:GluN2A免疫反应在小鼠小脑皮质Crus II的GrC中表达,提示GrC上含有GluN2A亚基的NMDAR参与突触传递与长时程可塑性。[结论]（1）活化或抑制NMDAR,尤其是含有GluN2A亚基NMDAR可以对感觉刺激诱发的小鼠小脑皮层MF-GrC突触传递产生显著增强或减弱作用。（2）阻断含有GluN2A亚基的NMDAR均可导致小鼠运动协调功能受损,表明含有GluN2A亚基的NMDAR在小鼠小脑皮层MF-GrC途径感觉信息突触传递和运动协调中起重要重要。（3）小鼠小脑皮质GrC存在含有GluN2A亚单位的NMDAR,面部感觉刺激诱导的MF-GrC LTP依赖于含有GluN2A亚单位NMDAR/NO级联反应,由PKA和PKC信号通路共同介导,并需要细胞内钙离子的参与。（4）本研究结果表明含有GluN2A亚基的NMDAR控制MF-GrC突触传递长时程可塑性,可能在动物的运动学习中起关键作用。