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氧化还原酶(Oxidoreductase)是重要的生物催化剂,其催化的氧化还原反应具有反应条件温和、立体选择性强等优点,但依赖NADH(NADPH)的氧化还原酶需要昂贵的辅酶参与反应。甲酸脱氢酶(Formate Dehydrogenase,FDH)在辅酶酶法再生中具有明显优势,甲酸/甲酸脱氢酶再生体系的明显优势在于其唯一副产物CO2对酶的活性没有影响,且易于从反应体系中逃逸出来。苯丙氨酸脱氢酶(Phenylananine Dehydrogenase,PheDH),在临床上可用于苯丙酮尿症的检测,且可与甲酸脱氢酶耦联合成苯丙氨酸。氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)具有独特的片层结构,其表面和边缘分布着羟基、环氧基和羧基含氧功能性基团。氧化石墨烯的高比表面积和良好的生物相容性,使其成为酶固定化的优良载体。本研究构建了基于氧化石墨烯衍生物的不同载体,用于氧化还原酶的固定化,目的在于提高酶的稳定性。本文的主要研究内容和结果如下:一、运用Hummers改良法制备氧化石墨烯,用X射线晶体衍射(XRD)、紫外-可见光谱(UV-Vis)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、荧光光谱(Fluorescence Spectra)对产物进行表征。分析结果表明在强氧化的过程中引入羟基、环氧基和羧基含氧功能性基团。二、构建了镍离子配位氧化石墨烯新型载体(GO-Ni),用于甲酸脱氢酶(FDH)固定化。与氧化石墨烯(GO)直接吸附相比,载体GO-Ni的酶负载能力提高了5.2倍,固定化酶GO-FDH和GO-Ni-FDH的酶活回收率分别为73.3%和86.7%。在60℃下温育3 h,GO-FDH和GO-Ni-FDH的相对酶活为18.2%和40.9%,而游离FDH剩余酶活仅为2.78%,固定化酶的热稳定性得到明显提高。且GO-Ni-FDH呈现更好的储藏稳定性和重复利用稳定性,在4℃的条件下储藏20天后,相对酶活为31.4%,经过8次的重复使用之后,其相对酶活为63.8%。利用圆二色谱和扫描电子显微镜对固定化酶的二级空间结构和形态进行表征和分析。固定化过程中,蛋白酶的二级结构发生了改变,载体GO-Ni与FDH之间存在着多层次多用力,可形成规则的晶体结构。三、构建了支链聚乙烯亚胺接枝氧化石墨烯载体(GO-PEI),用于固定化甲酸脱氢酶。相对于GO,载体GO-PEI的酶负载能力提高了 2.4倍,与FDH和GO-FDH相比,固定化酶GO-PEI-FDH的热稳定性、储藏稳定性和重复使用稳定性增强。在4℃条件下储藏20天后,GO-PEI-FDH的相对酶活为24.9%,经过8次的重复使用后,其相对酶活为47.4%。利用圆二色谱和扫描电子显微镜对GO-PEI-FDH进行表征和分析,考察了其固定化机理,发现静电相互作用是酶固定化的主要作用力。四、运用化学还原的方法对氧化石墨烯进行还原,得到还原时间为2 h、4 h、6h和12h的还原氧化石墨烯CRGO-2、CRGO-4、CRGO-6、CRGO-12,比较不同还原时间对于CRGO载酶能力的影响,发现还原时间越长,还原程度越大,蛋白负载能力增强,分别为0.278、0.362、0.521和0.587 mg/mg。固定化酶CRGO-2-FDH、CRGO-4-FDH、CRGO-6-FDH 和 CRGO-12-FDH 的酶活回收率分别为 88.6%、90.2%、90.3%和 90.6%。相对于固定化酶 GO-FDH,CRGO-12-FDH显现更好的热稳定性和重复使用稳定性,在60℃温育3 h后,剩余酶活为20.8%,经过8次的重复利用,相对酶活为70.4%。利用圆二色谱和扫描电子显微镜对CRGO-12-FDH进行表征和分析。五、用氧化石墨烯固定化苯丙氨酸脱氢酶(PheDH),GO改变了 PheDH的最适反应pH和最适反应温度。固定化酶GO-PheDH的酶活回收率为75.84%,经过8次的重复反应后,剩余酶活为13.15%。初步探究氧化石墨烯材料对苯丙氨酸脱氢酶的适用性。