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目的:膀胱癌是最普遍的泌尿系肿瘤之一。近年来,由膀胱癌引起的死亡人数逐年增加,在所有肿瘤中排名第13位。膀胱癌的发病风险与一些遗传和环境因素有关,手术,放疗和化疗是目前膀胱癌患者的主要治疗方法。膀胱癌患者的5年生存率很低,因为复发的风险很高。此外,促进膀胱癌的发生、发展的遗传机制目前还没有得到很好的理解。因此,迫切需要寻找新的膀胱癌早期诊断的生物学标志物。近年来,许多研究发现PRKCA在肿瘤发生发展中扮演着重要角色,位于许多信号转导通路的交叉点,对肿瘤细胞的增殖、凋亡及迁徙等功能具有调节作用。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种新近被人们认知的一种内源性非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）,可通过调控微小RNA（micro RNA,miRNA）的表达进而影响肿瘤细胞的生物学功能。本文通过对circRNA/miRNA/PRKCA轴对膀胱癌发生发展中作用及具体机制的探索,为circRNA对膀胱癌的靶向治疗策略提供理论基础。方法:1.PRKCA在膀胱癌组织与细胞系中表达检测及上游miRNA的筛选在中国医科大学泌尿外科标本库中选取57例膀胱癌组织与26例癌旁组织。提取癌组织和癌旁组织总RNA与总蛋白,采用qRT-PCR检测PRKCA mRNA表达量,采用Western blot检测PRKCA蛋白表达量。在7种膀胱癌细胞系中提取总RNA,并通过qRT-PCR检测PRKCA mRNA的内源性表达,选取两种合适的细胞系做剩余实验。在生物信息学网站（Targetscan,miRWalk,Oncomi R等）中筛选与PRKCA mRNA 3’-UTR区具有结合位点的miRNA。2.miRNA对PRKCA的调控机制及对膀胱癌细胞系功能的影响采用qRT-PCR在选取的组织样本中检测预测出的miRNA的表达量,验证是否存在差异。在膀胱癌细胞系中转染miRNA的mimics及inhibitor,检测PRKCA mRNA及蛋白的表达量的变化。根据生物信息学网站预测出的miRNA与PRKCA的结合位点,构建PRKCA3’UTR区域结合位点野生型以及突变体质粒,克隆至荧光载体。通过双荧光素酶报告基因实验,验证miRNA与PRKCA 3’UTR区域是否结合。在膀胱癌细胞系中,转染miRNA的mimics及inhibitor,通过CCK8细胞活性检测,EDU细胞增殖检测,流式细胞仪检测细胞凋亡的方法,验证mi RNA对膀胱癌细胞生物学特性的影响。在稳转PRKCA膀胱癌细胞系中,过表达miRNA,通过检测PRKCA mRNA及蛋白表达量的变化及功能回复实验验证miRNA是否通过调控PRKCA对膀胱癌细胞生物学特性产生影响。3.miRNA上游circRNA的筛选及结合验证利用TargetScan,Miranda,RNAhybrid等生物信息学网站预测,挑选与所研究miRNA具有碱基互补且未被研究的circ RNA。根据生物信息学网站预测出的circRNA与miRNA的结合位点,构建结合位点野生型以及突变体质粒,克隆至荧光载体。通过双荧光素酶报告基因实验,验证miRNA与circRNA是否在结合位点处结合。通过RNA pulldown试验及RNA免疫沉淀试验,验证miRNA与预测出的circRNA相互结合。4.验证circRNA对膀胱癌细胞生物学特性的影响利用qRT-PCR在标本库中的膀胱癌组织与癌旁组织中检测circRNA的表达量,验证是否存在差异。在膀胱癌细胞系中,沉默circRNA,通过CCK8细胞活性检测,EDU细胞增殖检测,流式细胞仪检测细胞凋亡的方法,验证circRNA对膀胱癌细胞生物学特性的影响。通过裸鼠成瘤实验,在4-6周Balb/c裸鼠皮下注射过表达circRNA的UMUC3稳转细胞系,观察移植瘤生长情况。通过免疫组化检测移植瘤Ki67表达含量的变化,判断circRNA对肿瘤增殖能力的影响。5.circRNA通过对miRNA/PRKCA的调控对膀胱癌细胞生物学特性产生作用在膀胱癌细胞系中,转染circRNA-si,采用qRT-PCR及Western blot实验检测PRKCA mRNA及蛋白表达量的变化。在膀胱癌细胞系中,分别转染circRNA-si及共转染circRNA-si与miRNA inhibitor,采用qRT-PCR及Western blot实验检测PRKCA mRNA及蛋白表达量的变化,并通过功能回复实验验证circRNA是否通过调控miRNA/PRKCA对膀胱癌细胞生物学特性产生影响。6.circRNA对激活/抑制NF-κB通路的验证在稳转LV-circRNA及转染circRNA-si的膀胱癌细胞系中,采用Western blot实验检测NF-κB通路中相关蛋白表达量的变化。回复实验验证circRNA是通过对PRKCA的调控对NF-κB通路产生激活/抑制的影响。结果:1.与对应的癌旁组织及人膀胱上皮永生化细胞相比,PRKCA在膀胱癌组织和7种膀胱癌细胞系中呈现出高表达。通过生物信息学网站预测miR-154-5p可与PRKCA mRNA 3’UTR区结合。2.与对应的癌旁组织相比,miR-154-5p在膀胱癌组织中呈现出低表达。在膀胱癌细胞系中转染miRNA的mimics及inhibitor,检测PRKCA mRNA及蛋白的表达量分别降低与增高。双荧光素酶报告基因实验证明miR-154-5p与PRKCA 3’UTR区域结合。通过CCK8细胞活性检测,EDU细胞增殖检测,流式细胞仪检测细胞凋亡的方法,证明miR-154-5p可抑制膀胱癌细胞活性与增殖功能,同时促进细胞凋亡。回复实验证实miR-154-5p是通过靶向调控PRKCA的表达对膀胱癌细胞生物学特性产生影响。3.通过生物信息学网站预测出circ0033506与所研究miRNA具有碱基互补序列。双荧光素酶报告基因,RNA pulldown试验及RNA免疫沉淀试验证明miR-154-5p与circ0033506在结合位点处结合。4.与对应的癌旁组织相比,circ0033506在膀胱癌组织中呈现出高表达。在膀胱癌细胞系中,沉默circ0033506,通过CCK8细胞活性检测,EDU细胞增殖检测,流式细胞仪检测细胞凋亡的方法,验证circ0033506可增强膀胱癌细胞活性与增殖功能,同时可抑制细胞凋亡。通过裸鼠成瘤实验及免疫组化检测证明circ0033506可增强移植瘤增殖能力,促进Ki67表达含量的增加。5.在膀胱癌细胞系中,转染circ0033506-si,发现PRKCA mRNA及蛋白表达量的降低,回复实验证明circ0033506是通过竞争性结合miR-154-5p来调控PRKCA的表达,并对膀胱癌细胞生物学特性产生影响。6.在稳转LV-circ0033506及转染circ0033506-si的膀胱癌细胞系中,NF-κB通路分别被激活和抑制。回复实验证明了circ0033506是通过对PRKCA的调控对NF-κB通路产生激活与抑制的影响。结论:在本研究中,我们通过生物信息学分析,发现circ0033506可作为miR-154-5p的吸附海绵,作为竞争性内源性RNA调控PRKCA的表达,起到了促癌基因的作用。同时可激活NF-κB通路,进而在膀胱癌细胞中发挥促进细胞增殖和抑制凋亡的作用,为膀胱癌的诊断与治疗提供了新的视角。