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研究背景子宫内膜癌（Endometrial Cancer,EC）是原发于子宫内膜的恶性肿瘤,近年发病率逐年上升。是我国第二常见的女性生殖系统恶性疾病,仅次于宫颈癌。子宫内膜癌一般分为两种:Ⅰ型子宫内膜癌,也称为内膜样腺癌（Uterine Endometroid Carcinoma,UEC）,约占80%;Ⅱ型子宫内膜癌,约占20%,大部分为浆液性乳头状腺癌（Uterine Serous Papillary Adeno-Carcinoma,USPC）。在子宫内膜癌的临床病理诊断中,P16INK4a在子宫浆液性乳头状腺癌中多为阳性。因此,其可以作为一种标记蛋白,是鉴别子宫内膜样腺癌和子宫浆液性乳头状腺癌的重要指标之一。既往研究认为,P16INK4A是抑癌蛋白,它是细胞周期蛋白激酶4/6（CDK4/6）的抑制剂,可以阻止细胞周期进展,抑制细胞增殖。当其结构或功能缺失时,会促肿瘤进展。近期批准上市治疗恶性肿瘤的Palbociclib,Abemaciclib等药物,其适应征即为P16INK4A表达阴性的恶性肿瘤。这些药物,模拟发挥内源性P16INK4A的功能,靶向抑制CDK4/6的活性,发挥良好的抑制肿瘤的效果。但是,在大多数子宫浆液性乳头状腺癌组织标本中,P16INK4A却存在过表达的现象。而且,越来越多的证据表明,抑癌蛋白P16INK4A可能在一些恶性肿瘤中发挥促癌作用。在宫颈癌和肝癌中,过表达的P16INK4A可以作为可以利用的靶点,靶向抑制其表达可以减缓癌细胞的生长和迁移,促进癌细胞的凋亡。因此,本研究将着眼于子宫内膜浆液性乳头状囊腺癌中P16INK4A过表达的现象,深入探索P16INK4A的功能及相关生物学机制。研究目的研究P16INK4A在子宫内膜癌中的生物学功能,深入探索其在肿瘤发生发展中的可能机制,基于上述研究结论开发新的靶向治疗方案。研究方法本研究拟采用免疫组织化学的方法,在组织学层面探索P16INK4A在子宫内膜浆液性乳头状腺癌中的表达情况。以细胞免疫化学和蛋白免疫印迹的方法,评估数株不同的子宫内膜癌细胞系中P16INK4A的表达情况,以选择合适的细胞系进行实验。应用shRNA敲减过表达P16INK4A的子宫内膜癌细胞系ETN-1中P16INK4A的表达水平,在二维和三维平面观察细胞的增值、迁移情况,检测其下游蛋白的表达情况。应用shRNA敲减下游蛋白的表达,在二维和三维平面观察癌细胞的增值。以蛋白免疫印记及免疫组织化学的方法,在细胞学和肿瘤组织体外培养系统中,探索GSK-J4对组蛋白甲基化程度的影响以及P16INK4A表达水平的变化。结果通过对XXX医院18个月内的121例子宫内膜癌组织标本进行免疫组织化学分析发现,70%的子宫内膜浆液性乳头状腺癌中,P16INK4A呈高表达;而在多数（88%）子宫内膜样腺癌中,P16INK4A呈低表达。在AN3CA、ETN-1、Hec 1A、Hec 108以及Nou-1等子宫内膜癌细胞系中,通过细胞免疫化学实验及蛋白免疫印迹实验发现,ETN-1呈 P16INK4A 高表达,而其他 4 株（AN3CA、Hec 1A、Hec 108 以及 Nou-1）子宫内膜腺癌细胞系则呈低表达或不表达。为进一步确定上述5个子宫内膜癌细胞株细胞周期蛋白激酶4/6（CDK4/6）的激酶活性,以不同浓度的Palbociclib（0.75μM、1.5μM、3μM、6μM、12μM）对上述5株子宫内膜癌细胞系进行给药处理,发现ETN-1对Palbociclib耐药,而另外AN3CA、Hec 1A、Hec 108以及Nou-1等4株细胞系则相对敏感,其IC50值分别为0.066 μM、1.741 μ M、0.714μ M、1.863 μM。以ETN-1细胞系作为实验对象,构建稳定转染四环素诱导表达shRNA的体系,对ETN-1细胞系中的P16INK4A进行敲减。实验发现,在二维和三维的细胞培养体系中,ETN-1细胞的增殖及迁移均明显下降,且下游RB蛋白表达下调;随后,利用同样的ShRNA体系,对ETN-1细胞系中RB的表达进行敲减,发现当RB的水平被下调后,细胞也出现了增殖受抑制的表现,与P16INK4A被敲减时相同。利用免疫组织化学和细胞免疫印迹的方法,在20例人类子宫内膜浆液性乳头状腺癌的组织学标本以及ETN-1细胞中都发现,P16INK4A的表达水平与组蛋白3赖氨酸27单甲基化（H3K27me1）呈正相关而与组蛋白3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）呈负相关;当给予组蛋白去甲基化酶6B（KDM6B）抑制剂GSK-J4后,ETN-1细胞以及体外培养的来源于人源化肿瘤移植瘤小鼠模型（PDX）的新鲜肿瘤组织中出现了 H3K27me3上调和H3K27me1下调,与此同时也伴有P16INK4A的下调,ETN-1细胞生长受到明显抑制,体外培养的新鲜PDX肿瘤组织的恶性程度也出现了明显地下降。结论P16INK4A在子宫内膜浆液性乳头状腺癌中发挥促癌作用,这一致癌作用可能是通过其下游RB蛋白的变化而发挥的;子宫内膜浆液性乳头状腺癌中,P16INK4A的表达由表观遗传机制调节;靶向抑制P16INK4A,对于子宫内膜浆液性乳头状腺癌具有良好的临床前景。