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以苯丙酮酸为底物,通过酶促反应制备L-苯丙氨酸分为两步:一是亚苄基海因水解制备苯丙酮酸;二是以苯丙酮酸和天冬氨酸为原料,通过菌体内的转氨酶将天冬氨酸上的氨基转到苯丙酮酸上生成苯丙氨酸。这是一个很复杂的生物反应体系,对这一体系的测定方法迄今未见报道。 液质联用技术在对有机合成,生物反应过程的原料及产品杂质分析、中间产物监测及反应机理研究方面有着巨大的应用价值和广泛的应用前景。本文将液质联用技术应用于酶法生产L-苯丙氨酸体系的研究,根据其生产工艺的特点,分别建立了亚苄基海因水解制备苯丙酮酸生产体系和天冬氨酸转氨酶生产L-苯丙氨酸体系的定性定量检测方法,为优化反应条件提供了方法,为整个L-苯丙氨酸生产体系的监控提供了有效的分析手段。 建立了亚苄基海因和苯丙酮酸的液相色谱定性定量检测方法,讨论了流动相的流速、极性等因素对亚苄基海因和苯丙酮酸容量因子和保留时间的影响。对液质联用中涉及到的各种电喷雾电离参数(CUR、IS、TEM、GS1、GS2)和质谱检测参数(DP、FP、EP、CE、CEP、CXP)进行了优化,建立了应用液质联用技术检测亚苄基海因水解制备苯丙酮酸体系的方法,并将其应用于实际体系的检测,得到良好的结果。 L-天冬氨酸和丙酮酸的紫外吸收均很小,用常规液相色谱直接检测效果不好,本文应用液质联用技术实现了对L-天冬氨酸和丙酮酸的直接检测,建立了L-天冬氨酸、丙酮酸和L-苯丙氨酸的定性定量检测方法,讨论了流动相的流速、缓冲盐种类、浓度、流动相极性和pH对L-天冬氨酸和丙酮酸分离度的影响,对液质联用中的各种电喷雾电离参数和质谱检测参数进行了优化,并应用于转氨酶生产L-苯丙氨酸实际体系的检测,为反应条件的优化和L-苯丙氨酸的生产和质量控制提供了有效的分析方法。 另外,本文对亚苄基海因、苯丙酮酸、L-天冬氨酸、丙酮酸和L-苯丙氨酸在电喷雾电离质谱中的裂解现象进行了研究,对它们的裂解机理进行了探讨,给出了上述化合物在电喷雾电离离子源中发生裂解的可能途径。 I<WP=5>综上所述,本文应用液质联用技术对酶法生产L-苯丙氨酸反应体系进行分析测定,获得了良好的效果,为进一步解析反应过程,优化反应条件提供了方法,实验研究的结果亦将在苯丙氨酸的生产和质量控制中发挥重要的作用。