目的:构建由mTERT启动子驱动m4-1BBL基因的重组腺病毒载体,对比由非特异性启动子--CMV启动子驱动m4-1BBL基因的腺病毒载体,从体内外实验探讨其治疗小鼠肝细胞肝癌的效果。方法:分别用PCR方法和RT-PCR方法从C57BL/6小鼠的组织中克隆其mTERT启动子基因和m4-1BBL基因,测序证实;按试剂盒操作分步将克隆成功的两个基因亚克隆到pAD/PL-DEST Gateway Vector载体系统上,构建重组腺病毒载体质粒pAD-mTERT-promotor-m4-1BBL,同样方法克隆对照组pAD-CMV-m4-1BBL和空载体病毒质粒pAD,PacⅠ将三种质粒线性化后用脂质体转染293A包装细胞,包装和扩增病毒:rAD、rAD-CMV-m4-1BBL和rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL,细胞免疫化学方法证实病毒扩增成功。分别用上述三种病毒转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6和小鼠成纤维细胞株L929,用m4-1BBL的流式直标单克隆抗体检测添加不同滴度的病毒后m4-1BBL分子在两种细胞表面的表达;以MOI=10的浓度分别添加病毒到Hepa1-6和L929细胞中,MTT检测单纯添加病毒对两种细胞生长曲线的影响,AnnexinⅤ和PI检测添加病毒后细胞的凋亡情况,判断单纯添加病毒对两种细胞的影响;提取同源小鼠脾淋巴细胞,用小鼠T淋巴细胞阴性选择免疫磁珠纯化脾淋巴细胞为T淋巴细胞,用植物血凝素（PHA）和小鼠功能性CD3和CD28抗体分别活化脾T淋巴细胞,将活化好的T淋巴细胞加入已经添加各种病毒的两种细胞中进行淋巴细胞混合培养,MTT检测病毒对两种细胞生长的影响,AnnexinⅤ和PI检测添加病毒和活化T淋巴细胞后靶细胞的凋亡情况;将Hepa1-6以不同的数量接种到同源小鼠的皮下,观察小鼠皮下种植瘤的成瘤情况;以3×10⁶数量建立小鼠肝癌皮下种植瘤模型,给已经建立种植瘤的小鼠瘤内多点注射三种不同的重组腺病毒载体,观察腺病毒载体对肿瘤的治疗作用,抽取小鼠的血液检测肝功能情况,摘取肿瘤或肿瘤部位及相应个体小鼠的肝脏进行病理学检查;将三种重组腺病毒载体转染Hepa1-6细胞,以3×10⁶数量将不同的转基因肿瘤细胞及野生株肿瘤细胞接种到同源小鼠皮下,研究转基因的肿瘤细胞的成瘤情况,摘取肿瘤进行病理学检查,观察淋巴细胞的浸润情况。结果:1.经PCR检测和直接测序证实克隆的mTERT启动子基因和m4-1BBL基因与GeneBank上的序列完全一致,证实目的基因克隆正确;2. PCR证实亚克隆的重组腺病毒质粒中含有（或排除含有）相应的基因;3.细胞免疫化学方法证实病毒在293A细胞中扩增成功并测定其滴度达到1×10¹⁰pfu/ml;4.将上述三种病毒以不同的滴度转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6和小鼠成纤维细胞株L929,发现添加了rAD的两种细胞中均不能检测到m4-1BBL分子的表达,在添加了rAD-CMV-m4-1BBL的两种细胞中都检测到了高表达的m4-1BBL分子,添加了rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL的Hepa1-6细胞上检测到了较高表达的m4-1BBL分子,而在L929细胞上没有检测到有明显意义的m4-1BBL分子表达;5.对比三组在不同时间和不同添加滴度m4-1BBL的表达发现,MOI=10的滴度对靶细胞的影响较小,添加病毒后48小时m4-1BBL分子的表达较高;6.将三种病毒以MOI=10的滴度添加给两种细胞,发现三种病毒对两种细胞均有一定的抑制作用,以rAD-CMV-m4-1BBL最为明显,其抑制作用与其它两种病毒的差异有显著统计学差异（P<0.05）,对两种细胞的抑制作用在rAD和rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL两种病毒之间没有差异（P>0.05）,在上述滴度和时间点检测添加病毒后两种细胞的凋亡情况,发现添加rAD-CMV-m4-1BBL对两种细胞都有较强大的促凋亡作用,而添加rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL仅在小鼠肝癌细胞株Hepa1-6有较强的促凋亡作用,对非肿瘤细胞L929则无;添加rAD对两种细胞均无促凋亡作用;7.用CD3直标流式抗体检测磁珠纯化后的小鼠脾T淋巴细胞,发现其CD3的表达率达到95%以上;分别用植物血凝素（PHA）和功能性CD3CD28顺序活化纯化后的T淋巴细胞,在显微镜下发现细胞均出现聚团现象,流式检测发现经过功能性抗体活化后的CD69和CD25在48小时的表达率均达到50%左右;8.将活化后48小时的T淋巴细胞与已经添加三种病毒48小时的两种细胞进行淋巴细胞混合培养,MTT观察两种细胞的生长情况,发现:无论是单纯添加活化T细胞还是添加任何一种病毒的两种细胞,均与正常对照组的细胞的生长之间有显著的统计学差异（P<0.05）;单纯添加活化T细胞组与添加任何一种病毒的两种细胞生长之间同样存在显著的统计学差异（P<0.05）;与活化T细胞混合培养的添加rAD-CMV-m4-1BBL的两种细胞的生长抑制明显强于混合培养的添加rAD或rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL病毒（ P<0.05 ） ; rAD和rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL两组之间差异不明显（P>0.05）;将上述5组细胞分别在12、24、48和72小时检测靶细胞的凋亡情况,发现加入了活化T淋巴细胞与添加了病毒的两种细胞进行混合培养后,各组细胞的凋亡情况均加重了,尤其是rAD-CMV-m4-1BBL组;添加rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL与活化T淋巴细胞进行混合培养的Hepa1-6细胞凋亡明显,而添加rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL与活化T淋巴细胞进行混合培养的L929细胞凋亡则不明显,其它组别的两种细胞凋亡情况均不明显;9.给C57BL/6小鼠皮下注射不同数量的Hepa1-6细胞,发现3×10⁶和4×10⁶组成瘤情况较好,与其它组别（1×10⁶和2×10⁶）比较有显著的统计学差异（P<0.05）,但3×10⁶和4×10⁶两组之间无统计学差异;10.以3×10⁶个Hepa1-6细胞皮下注射建立C57BL/6小鼠皮下肝癌移植瘤模型,将三种重组腺病毒载体瘤内注射发现:注射rAD-CMV-m4-1BBL重组腺病毒载体小鼠的皮下肿瘤基本上消失了,而注射rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL的小鼠肿瘤明显缩小,注射rAD小鼠肿瘤大小变化不大,注射PBS的小鼠肿瘤进行性增大,整个实验期间各组小鼠无明显死亡现象,肝功能检测发现,注射rAD-CMV-m4-1BBL的个体谷丙及谷草转氨酶的水平高于其它各组,差异有显著的统计学差异（P<0.05）,其余各组间差异不明显（P>0.05）,组织切片显示:注射rAD-CMV-m4-1BBL的小鼠肿瘤部位未见到正常肿瘤细胞,仅遗留肿瘤细胞的残骸（细胞轮廓）,有淋巴结增生,注射rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL的小鼠肿瘤部位可见小片带状癌巢,淋巴细胞浸润,坏死灶散在,癌巢小,空泡状,有淋巴结增生,瘤内注射PBS组细胞大小不一,排列紊乱,核大,空泡状,核仁深染,未见明显坏死及淋巴细胞浸润,瘤内注射rAD组细胞大小不一,排列紊乱,核不规则,核大深染,可见病理分裂相,有灶状坏死,坏死区及周围纤维组织中见少量淋巴细胞浸润;瘤内注射rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL和rAD-CMV-m4-1BBL两组动物的肝脏出现肝板形态略不规整,汇管区未见淋巴细胞浸润,胞浆淡,细胞形态规整,无明显坏死的镜下表现,两组间差异不明显,其他各组与正常组之间没有明显差异。11.将转基因的肿瘤细胞Hepa1-6接种到小鼠皮下,发现rAD-CMV-m4-1BBL的转基因肿瘤细胞接种后肿瘤没有生长,rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL的转基因肿瘤细胞接种后肿瘤小且生长缓慢,rAD及野生株肿瘤细胞能在体内建立肿瘤,生长较快,两组间大小及生长速度没有差异,病理切片CD4及CD8检查发现rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL转基因细胞的CD8阳性细胞浸润明显,与其它组存在明显统计学差异（P<0.05）,其它组间差异不明显。结论:重组腺病毒rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL具有和rAD-CMV-m4-1BBL一样治疗肿瘤的效果,且具有针对肿瘤细胞的靶向性。比rAD-CMV-m4-1BBL更安全,能明显减少rAD-CMV-m4-1BBL的肝脏毒副作用,因此,rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL比rAD-CMV-m4-1BBL更具优越性。