ITS2是植物物种鉴定的核心条形码,也是系统发育分析最常用的基因之一,在药用植物鉴定和保护、入侵物种的防治等领域发挥着不可或缺的作用。因此,充分和正确使用其遗传信息至关重要。ITS2转录后以“一环四臂”的二级结构参与核糖体的组装过程,由于功能约束,它在整个真核生物界都十分保守。在功能与高级结构联系更加密切的前提下,其功能约束下的进化模式及其潜在的系统发育意义目前依然不够清晰。因此本研究(1)首先分别从大类群(门)、目、科和属不同类群进化框架下,通过拆分计数、序列比对、碱基定位、形状量化等方法从二级结构的各部位组成、碱基配对频率、保守序列位置、及结构形状的保守性几个方面探索ITS2二级结构的进化是否具有方向性和相应的规律。(2)为找到ITS2二级结构在进化中表现出的保守性和变化性的内在动力,本文还利用PHASE工具包的mcmcphase功能对二级结构碱基和配对的替换过程和特点进行了追踪和统计,最终得出以下结论:ITS2二级结构保守性:(1)在已知的ITS2二级结构共性的基础上,对植物类群中该结构的保守性特点有新的发现:ITS2碱基的GC含量高(61.26%),整体G>C>U>A;在不同区域,CG含量有一定的偏好:配对区的GC含量为(69.88%),远高于非配对区的CG含量(46.54%);在以配对为主的区域里,鸟嘌呤G的含量明显偏高,而腺嘌呤A的含量明显偏低,非配对区则相反,尿嘧啶U和碱基C的含量在不同的区域比较恒定;在不同的组成部分中,嘌呤数和嘧啶数均占50%左右;比对后,ITS2核酸序列中的保守序列区域(conserved subsequences)与二级结构的位置有关。ITS2二级结构变化性:(2)首次对ITS2二级结构在不同阶元的进化方式进行了探索,发现无论取样分类水平的高低,ITS2二级结构在发挥正常功能的前提下,变异并未随着类群的进化表现出明显的方向性。这说明了从绿藻到被子植物的进化过程中,ITS2的某些区域受到强烈的功能约束,另一些区域显现变化的多样性。(3)遗传距离对ITS2的一致性结构影响较大。ITS2—致性二级结构随着取样矩阵序列间亲缘关系远近呈现出不同的变化:各统计数值的离散程度逐渐变小;在属阶元,ITS2二级结构的变异程度与核酸序列的变异程度有更为明显的正相关。而在更高的阶元,这种相关性变得不明显。此结果对利用ITS2二级结构进行系统发生重建工作具有参考意义。ITS2二级结构进化的本质特点:(4)在功能约束下,ITS2序列配对区域和非配对区域的碱基和配对的替换方式有差异,非配对的碱基替换符合常用的REV碱基替换模型,而配对区的碱基组成和碱基对的替换方式更多是朝维持二级结构热力学稳定的方向进行。(5)我们选取紫堇属(Coryaiote)延胡索组(C.sect.Corydalis)进行了密集取样和ITS2克隆测序以探索在二级结构配对区补偿碱基替换(CBC)的过程。由于中间过渡碱基对(GU)的不稳定性,CBC的进化过程在具体的类群中很难被发现,其变异规律和系统学价值尚不清晰。本研究证实了 CBC在类群中的完整的进化过程(GC→GU→AU)分两步进行,在此基础之上,我们进一步证明了CBC在物种界定和分类学中的价值。与前人在深层系统发育关系研究上的研究结果不同,我们发现CBC并未显著影响构建正确的近缘类群系统发育关系。通过上述结果,本文建议在利用各种方法使用ITS2二级结构信息的过程谨慎对待科以上的阶元或远的亲缘关系;同时,本研究将加深人们对二级结构本身和其进化特点的认识,从而为更好地利用二级结构打下基础。