肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种慢性肝脏疾病导致的细胞外间质（extracellular matrix，ECM）成分过多合成及异常沉积，是各种慢性肝损伤共同的病理变化，有很高的发病率和死亡率。肝纤维化的主要病因包括病毒性肝炎、酒精中毒以及胆道梗阻等。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）在肝纤维化的形成过程中发挥关键作用。正常情况下，HSCs主要储存维生素A，并发生少量增殖，合成少量胶原。然而，肝损伤后，HSCs内维生素A消失并转化成肌成纤维样细胞，即活化的HSCs，表达α―平滑肌肌动蛋白（α―smooth muscle actin，α―SMA）并且合成各种ECM成分。活化的HSCs不仅是ECM的主要来源，还表达参与ECM降解的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）及其抑制因子(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs)。诸多细胞因子和生长因子可以影响HSCs活化，调节MMPs及TIMPs的分泌。然而，最近发现细胞-ECM间的相互作用与这些因子一样，可以调节HSCs分泌MMPs和TIMPs。整合素（integrin）是广泛存在于细胞表面的跨膜糖蛋白，是ECM成分的主要受体，是细胞内外信息交流的桥梁，因此，整合素可能介导了ECM对MMPs和TIMPs分泌的调节。ECM与整合素结合首先引起粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK)分子聚集在粘着斑（focal adhesion plaque，FAP）处，使FAK N-端区的酪氨酸Tyr397磷酸化而被激活。FAK激活后可能激活多条信号途径，其中比较清楚的是RAS依赖的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径。细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）是MAPK家族中研究得最为清楚的成员，其通路RAS-RAF-MEK-ERK参与细胞多种功能活动。本研究从HSCs与ECM之间的相互作用着手，以FAK、ERK1/2为切入点，有机结合整体和离体试验，研究整合素信号通路在<WP=5>肝纤维化及HSCs中对MMP及TIMP的影响。实验内容主要包括以下四部分：第一部分：MMP-13、TIMP-1在大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达目的：探讨实验性大鼠肝纤维化形成过程中与ECM代谢有关的MMP-13、TIMP-1的动态表达以及TIMP-1与ECM主要成分I型胶原之间的相互关系。方法：采用胆总管结扎(bile duct ligation，BDL)大鼠肝纤维化模型，将80只雄性Sprague Dawley大鼠随机分成假手术组与模型组。模型组分别于结扎后2h、6h、2d、1wk、2wk、3wk、4wk麻醉动物，假手术组与4wk模型组同批麻醉。采用HE染色确定模型建立情况，Masson三色染色测定ECM沉积情况；免疫组织化学方法研究Ⅰ型胶原在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变化；RT-PCR方法研究MMP-13 mRNA在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变化；原位杂交和Western blot技术分别观察TIMP-1 mRNA及蛋白表达情况。结果：①Masson三色染色显示随着肝纤维化的发展，造模1～4wk大鼠肝组织内胶原纤维所占的面积（10.41%±1.33%，17.32%±1.53%，33.67%±2.28%，42.63%±1.68%）均显著高于假手术组（7.35%±1.14%），P＜0.05。②随着肝纤维化发展I型胶原在肝脏内大量沉积，从汇管区向外延伸，并广泛存在于纤维间隔及增生的小胆管周围，中央静脉周围强阳性染色，增生的粗大的胶原纤维包绕肝细胞形成明显的假小叶，Disse间隙内有I型胶原沉积。造模1wk、2wk、3wk和4wk大鼠肝组织内的I型胶原阳性面积分别为8.57±1.88%，13.51±2.93%，30.88%±3.30%，38.05±3.72%，除第1wk外,其余各组均显著性高于对照组假手术组（5.35±1.88%），P＜0.01。即肝纤维化程度越重，I型胶原染色阳性面积所占比例越大。③MMP-13 mRNA在肝纤维化形成过程中无明显变化。④随着结扎时间的延长，TIMP-1 mRNA的表达呈持续上升趋势．造模1wk、2wk、3wk和4wk大鼠肝脏组织内TIMP-1 mRNA阳性面积分别为17.59%±1.70%，25.89%±1.93%，31.82%±1.24%，37.29%±2.65%，均显著高于假手术组(4.77%±0.97%)，P＜0.01，与Ⅰ型胶原呈显著正相关。⑤正常肝组<WP=6>织TIMP-1蛋白微量表达，造模6h开始上调，造模4wk TIMP-1表达最高，比假手术组增加1倍以上。结论：肝纤维化形成过程中ECM沉积是其主要病理改变，其中Ⅰ型胶原增加最明显；肝纤维化形成过程中主要是TIMP-1表达的变化，无论是蛋白水平还是mRNA水平，都显著增加，MMP-13 mRNA无显著变化。第二部分：精-甘-天冬-丝氨酸四肽对肝星状细胞胶原代谢的影响及机制研究目的：探讨精-甘-天冬-丝氨酸(RGDS)四肽对纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）刺激的HSCs合成胶原、表达MMP-13以及TIMP-1的影响，为利用RGDS四肽调控HSCs胶原代谢提供实验理论依据。方法：应用体外HSCs培养技术，采用3H-脯氨酸(3H-pro)掺入法测定HSCs胶原合成；采用甲苯胺兰染色方法测定细胞粘附率；RT-PCR方法检测MMP-13 mRNA水平；应用原位杂交和Western blot技术分别检测TIMP-1 mRNA和蛋白水平。阴性对照组采用精-甘-谷-丝氨酸（RGES）四肽。结果：①RGDS四肽25μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1组对HSCs 3H-pro掺入结果与对照组、FN组相比，均显著下降，P＜0.01，掺入抑制率分别是23.15%、