【摘 要】
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目的:探究DAB2IP对肿瘤细胞侵袭性伪足形成及功能的影响。方法:利用si RNA干扰技术下调T47D细胞内源性DAB2IP的表达;在MDA-MB-231细胞中利用PCI-neo-DAB2IP质粒构建高表达DAB2IP的稳定细胞株;同样利用si RNA干扰技术下调正常永生化上皮细胞MCF10A(乳腺导管上皮)内源性DAB2IP表达。通过蛋白免疫印迹,细胞免疫荧光实验检测肿瘤细胞侵袭性伪足的形成能力
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目的:探究DAB2IP对肿瘤细胞侵袭性伪足形成及功能的影响。方法:利用si RNA干扰技术下调T47D细胞内源性DAB2IP的表达;在MDA-MB-231细胞中利用PCI-neo-DAB2IP质粒构建高表达DAB2IP的稳定细胞株;同样利用si RNA干扰技术下调正常永生化上皮细胞MCF10A(乳腺导管上皮)内源性DAB2IP表达。通过蛋白免疫印迹,细胞免疫荧光实验检测肿瘤细胞侵袭性伪足的形成能力;利用明胶降解实验检测细胞侵袭性伪足降解基质的功能。结果:在低侵袭性乳腺癌细胞T47D中,细胞免疫荧光实验表明:低表达内源性DAB2IP可以明显促进侵袭性伪足的形成;而在高侵袭性的乳腺癌细胞MDA-MB-231中,高表达外源性DAB2IP可以明显抑制侵袭性伪足的形成。明胶降解实验表明:在T47D细胞中低表达内源性DAB2IP可以显著增强侵袭性伪足的功能(明胶降解能力),而在MDA-MB-231细胞中高表达外源性DAB2IP可以显著降低其侵袭性伪足的功能(明胶降解能力);最后,我们在正常的永生化乳腺导管上皮细胞MCF10A中,通过细胞免疫荧光实验和明胶降解实验同样证实:下调内源性DAB2IP的表达可以明显抑制侵袭性伪足的形成及功能。结论:DAB2IP可以抑制肿瘤细胞侵袭性伪足的形成及功能(明胶降解能力)。目的:探讨DAB2IP调控侵袭行伪足形成的可能机制。方法:在永生化的正常乳腺导管上皮细胞MCF10A中,通过si RNA技术低表达内源性DAB2IP,利用蛋白质免疫共沉淀技术(Co-IP)检测Cortactin的酪氨酸磷酸化水平;利用蛋白激酶芯片技术和蛋白质免疫共沉淀技术(Co-IP)寻找调控Cortactin的潜在关键蛋白激酶;通过蛋白质免疫沉淀实验检测DAB2IP对肿瘤细胞中此关键蛋白激酶的影响;最后,在之前的细胞体系中,利用si RNA干扰技术和蛋白激酶特异性抑制剂分别干扰该此关键蛋白激酶的表达和活性,然后检测能否逆转DAB2IP对Cortactin421位点的酪氨酸磷酸化水平、侵袭性伪足的形成及功能的影响。结果:在MCF10A细胞中,与对照组细胞相比,下调内源性DAB2IP的表达可以明显增强Cortactin的总酪氨酸磷酸化水平;进一步通过蛋白质免疫沉淀实验表明:在MCF10A细胞中,干扰DAB2IP表达后可以明显增强Cortactin 421位点的酪氨酸磷酸化,而在MDA-MB-231细胞中,高表达DAB2IP后则明显降低Cortactin 421位点的酪氨酸磷酸化水平。利用蛋白激酶芯片技术和蛋白质免疫共沉淀技术(Co-IP)筛选分析,最终确定ALK作为调控Cortactin的潜在关键蛋白激酶,蛋白质免疫沉淀实验表明DAB2IP可以负向调控ALK的蛋白表达。最后,在下调MCF10A细胞内源性DAB2IP表达的基础上,利用si RNA干扰技术和ALK蛋白激酶特异性抑制剂(ASP3026)分别抑制ALK的表达和活性,可以明显逆转DAB2IP对Cortactin 421位点的酪氨酸磷酸化水平、侵袭性伪足的形成及功能的促进作用。结论:DAB2IP可能通过降低ALK的蛋白表达进而抑制Cortactin421位点的磷酸化,从而调控侵袭性伪足形成及功能。
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