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鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引起的危害雏鸡的一种急性、高度接触性、传染性疾病。IBDV感染后能够迅速到达其靶器官——法氏囊。病毒的大量复制导致产生抗体的B淋巴细胞的崩解和缺失,使鸡体产生免疫抑制,进而引起疫苗的免疫失败和增加对其它病原微生物的易感性。IBDV有2个血清型:对鸡具有致病性的血清I型和无致病性的血清II型。血清I型IBDV根据其毒力和致病性,分为经典毒株、变异株、超强毒株和弱毒疫苗株。IBDV共编码5个蛋白(VP1-VP5),其中VP5为非结构蛋白,首先由Mundt发现仅存在于IBDV感染细胞内,不是病毒的组成成分;随后研究发现,VP5为病毒复制非必需,但缺失后可以降低病毒的复制效率和致病性。显然,VP5在IBDV的感染过程中具有重要作用,以往对VP5的功能研究取得了一定进展,但其在IBDV感染中的功能及其作用机理有待于进一步研究。本研究首先以弱毒IBDV(rGt株)和适应CEF生长保留一定毒力的人工修饰病毒(rGx-F9VP2株)为亲本病毒,利用体外定点突变技术,突变VP5基因起始密码子,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组A节段插入真核表达载体pCAGGs的β肌动蛋白启动子下游,构建了缺失表达VP5蛋白的IBDV感染性克隆pCGtA△VP5HRT和pCGx-F9VP2A△VP5HRT,将A节段感染性克隆分别与相应B节段感染性克隆pCmGtBHRT或pCmGxBHRT共转染DF I细胞。RT-PCR和IFA均显示获得重组病毒,缺失表达VP5蛋白,将其分别命名为rGt△VP5和rGx-F9VP2△VP5。体内外实验分析结果表明:缺失表达VP5蛋白降低病毒的复制效率和对细胞的毒性,以及对SPF鸡的致病性和免疫抑制作用。为了比较强弱毒VP5蛋白功能的差异,利用融合PCR技术,分别以弱毒IBDV(rGt株)和人工修饰强毒(rGx-F9VP2株)为亲本毒,进行强弱毒VP5基因替换,构建A节段嵌合感染性克隆pCGtAGxVP5HRT和pCGx-F9VP2AGtVP5HRT,分别与pCmGtBHRT和pCmGxBHRT共转染DF I细胞。通过RT-PCR和IFA检测,获得重组嵌合病毒,将其分别命名为rGtGxVP5和rGxGtVP5。进行体内外实验分析,rGtGxVP5与rGt具有相同的复制效率和最高病毒滴度,感染后诱导细胞凋亡的能力和对细胞活力影响相同;rGxGtVP5和rGx-F9VP2感染SPF鸡,法氏囊BBIX和HBLS差异不显著,诱导产生抗体水平相同。结果表明,替换强毒VP5基因不影响弱毒株在CEF细胞的生物学特性,替换弱毒VP5不能降低强毒体内致病性,强弱毒VP5蛋白在复制和致病性方面具有相同功能,不是强弱毒株复制特性和致病性差异的决定因素。根据VP5蛋白预测结构,利用体外定点突变技术,分段缺失表达弱毒IBDV(rGt株)VP5蛋白,并构建A节段感染性克隆pCGtA△VP5N70HRT,pCGtA△VP5N90HRT和pCGtA△VP5C51HRT,并分别与pCmGtBHRT共转染DF I细胞。RT-PCR和IFA均显示获得重组缺失病毒,将其分别命名为rGt△VP5N70,rGt△VP5N90和rGt△VP5C51。进行体外复制能力分析,rGt△VP5C51具有与亲本病毒rGt相同的复制效率,而rGt△VP5N70和rGt△VP5N90相对于rGt降低了在CEF细胞上的复制能力。结果表明,VP5蛋白影响病毒复制效率的功能区位于N端1-94个aa内,C端51个aa不影响IBDV体外复制。为了研究VP5在IBDV感染中的分子作用机制,通过rGt和rGt△VP5感染CEF细胞诱导产生干扰素(Interferon, IFN)差异比较,发现,rGt△VP5诱导细胞产生IFN的能力高于rGt,推测VP5蛋白能够抑制宿主细胞产生IFN;并构建表达VP5蛋白的真核重组质粒pCAGGVP5,分别与在ISRE、NF-κB或Mx启动子调控下表达萤火虫荧光素酶的报告基因质粒共转染,用dsRNA刺激后,分析萤火虫荧光素酶的表达。结果,体外表达VP5蛋白抑制ISRE、NF-κB和Mx启动子的激活;表明,VP5蛋白能够抑制细胞产生IFN,推测VP5蛋白通过抑制IFN的产生影响病毒的复制和致病性。由于VP5在IBDV感染中特殊的作用,VP5基因被认为是标记疫苗研究的重要候选基因。本研究分别对嵌合血清II型IBDV(23/82株)VP5基因的重组病毒rGt2382VP5和缺失表达VP5蛋白人工修饰强毒rGx-F9VP2△VP5进行体内外特性分析。首先,利用大肠杆菌表达的IBDV 23/82株VP5蛋白为抗原,免疫Balb/C小鼠,融合筛选获得一株分泌特异性识别血清II型IBDV23/82株VP5蛋白的杂交瘤细胞株(5D3);并利用融合PCR技术,以血清I型弱毒IBDV(rGt株)为骨架,构建替换血清II型IBDV(23/82株)VP5基因的A节段嵌合感染性克隆pCGtA2382VP5HRT,与pCmGtBHRT共转染DF I细胞。通过RT-PCR和IFA检测,获得重组嵌合病毒,将其命名为rGt2382VP5,该病毒能被抗血清II型IBDV-VP5型特异性McAb(5D3)识别。体外生物学特性分析发现,rGt2382VP5复制能力和对CEF细胞毒性低于亲本病毒rGt,表明,替换23/82株VP5基因降低了弱毒株的复制效率和细胞毒性,VP5基因是两个血清型IBDV致病性差异的因素之一。由于缺失表达VP5蛋白的强毒株rGx-F9VP2△VP5能够诱使感染SPF鸡产生中和抗体,为了验证其保护效力,分别将rGx-F9VP2△VP5与其亲本病毒rGx-F9VP2接种3周龄SPF鸡,4周后攻击vvIBDV(Gx株),统计保护效率。结果表明:两株病毒接种后,均能够保护SPF鸡抵抗vvIBDV攻击,rGx-F9VP2△VP5具有作为标记疫苗的潜力。本研究构建一系列缺失和嵌合病毒,并进行体内外生物学特性研究,证实VP5影响病毒在体内外的复制效率和致病性,强弱毒VP5功能不存在差异,其影响病毒复制效率的功能区位于N端1-94个aa内;VP5通过抑制宿主细胞产生IFN而影响病毒的复制和致病性;VP5是血清I、II型IBDV致病性差异的决定因素之一;rGx-F9VP2△VP5能够诱使鸡体产生中和抗体,保护其抵抗vvIBDV的攻击,具有作为疫苗株的潜力。本研究进一步阐述了VP5的功能和IBDV感染的分子致病机理,为基于VP5基因的标记疫苗的研发提供理论基础和物质基础。