绿海龟（Chelonia mydas）是海洋旗舰物种、伞护物种,一直以来被人们视为海洋生态系统的健康指示器。由于长期过度利用,绿海龟已成为濒危物种,被列为国家一级重点保护野生动物。研究绿海龟易感病原体对保护绿海龟具有重要意义,而新型病毒的检测是绿海龟保护过程中最薄弱的环节。目前大量的放生活动都未对绿海龟的病原体携带状况进行有效的风险评估,这对绿海龟的种群健康带来了严重威胁。放生前的救助环节已成为各类病原体滋生的温床,受限于场地等因素,救助绿海龟的空间往往十分有限,这种有限空间下的高密度养殖使得许多病原体突破了绿海龟的免疫防线。2018年至2022年间,海南文昌、琼海等地的养殖点不断有不明原因绿海龟群体死亡现象发生,存活个体也会陆续发病死亡。本研究利用NGS（Next Generation Sequencing）测序方法对病死绿海龟进行了检测,测序结果与正常搁浅死亡绿海龟进行比对,获得了一种新型绿海龟丙肝病毒的全基因组序列,将其暂命名为ChHCV,该病毒极可能与绿海龟死亡存在密切关联性。对序列进行Sanger测序验证后,与已知同属病毒进行了比较和分析,建立了ChHCV的检测方法,而后对海南地区的养殖、救助、野生绿海龟进行了流行病学研究,初步摸清了该病毒的流行规律。本研究对筛查海龟未知易感病毒具有示范作用。主要研究结果及创新点:1.基于NGS方法的ChHCV全基因组序列获取对海南文昌、琼海的多只人工养殖病死绿海龟进行了剖检,选取脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、组织液等作为样本进行了NGS测序,同时,对另一只海滩搁浅死亡的绿海龟也进行了相同的操作。NGS测序结果显示,海滩搁浅死亡的绿海龟体内仅含有龟疱疹病毒5型等常见病毒,人工养殖病死绿海龟体内除含有龟疱疹病毒5型以外,还含有黄病毒科的新型病毒。将获得的NGS测序数据用自主研发的用于甄别未知病毒的分析流程进行处理,运用生物信息学技术得到了一种新型绿海龟丙肝病毒的全基因组序列。绿海龟体内发现丙肝病毒为全球首次报道,也是首次在海龟科动物体内发现黄病毒科病毒。2.ChHCV全基因组序列分析及验证采用NGS测序方法拼接获得了1株新型丙肝病毒,基因组大小为9430 bp。对ChHCV进行系统发育分析,发现海龟体内的丙肝病毒是黄病毒科丙肝病毒属的一个新种。而后对病毒基因组进行Sanger测序验证,每间隔1000 bp左右设计1对引物,将前序结果中的简并碱基测通的同时,对NGS测序结果进行了完整的验证,得到了准确的ChHCV基因组全长,其GC含量为45%。根据Sanger测序结果修正完善了NGS测序结果的20个碱基,Sanger测序结果与NGS测序结果的一致性为99.79%。3.ChHCV检测方法的建立建立了ChHCV realtime RT-PCR检测方法。针对ChHCV病毒基因组中的保守序列,摸索了多对引物探针,选择其中一对建立了检测方法,可准确检测ChHCV。所建立的检测方法特异性较好,可有效区分龟疱疹病毒5型（Chelonid herpesvirus 5,ChHV5）、真鲷虹彩病毒（Red sea bream iridovirus,RSIV）、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus,Vp AHPND),除ChHCV外,反应物在realtime RT-PCR反应时未出现典型“S”型曲线。所建立的检测方法灵敏度较高,最低检测限为2.6拷贝/μL。重复性较好,重复试验变异系数为0.200%～0.664%。所建立的检测方法可用于养殖、搁浅、野生绿海龟的ChHCV监测。4.ChHCV流行病学研究根据本研究所建立的病毒检测方法,对海南省内各养殖点、救助站、搁浅及野生绿海龟进行了ChHCV检测。其中养殖点采集77只,25只检出ChHCV;采集救助个体26只,8只检出ChHCV;采集搁浅个体1只,野生个体2只,均未检出ChHCV。本研究共采集绿海龟个体106只,共检出ChHCV阳性个体33只,总检出率为31.1%。在纯野生绿海龟中并未发现ChHCV感染,人工养殖环境可能是病毒发生和传播的主要因素,规范海龟放生活动迫在眉睫。