关于调节性(regulatory)/抑制性(inhibitory)/致耐受性(toleragenic)免疫应答是目前免疫学及相关学科的研究热点，口服抗原耐受和呼吸道抗原耐受的研究已较为深入，并进入临床应用阶段。然而，透过完整皮肤能否诱导免疫耐受尚不明确。　　皮肤被覆体表，是对外界环境刺激发生应答的第一道免疫防线。随着对皮肤功能的深入研究，越来越多的学者提出：皮肤不仅是一种物理屏障，还具有免疫调节功能。皮肤中存在着大量的免疫成分，例如角质细胞、朗格汉斯细胞、内皮细胞以及各种细胞因子成分，共同维持着免疫系统的自稳态。以往研究报道，通过在皮肤表面应用抗原和佐剂可以诱导显著的免疫应答，这种透皮免疫（transcutaneous immune，TCI）主要是以去表皮角质或斑贴等方法使抗原有效地穿过表皮，从而诱导系统免疫。因此表皮破损或炎症是透皮免疫的先决条件。而在完整的皮肤上外用抗原所产生的免疫效应并不明确。本研究在前期工作中利用完整皮肤外用抗原的动物模型，观察到完整皮肤外用抗原可以有效抑制之后的口服抗原致敏，首次揭示了经皮肤耐受的现象，但其机制尚不明确。　　位于皮肤的树突状细胞(dentritic cells,DCs)作为重要的抗原提呈细胞在皮肤耐受中可能发挥着重要作用，正常情况下，皮肤中的DCs处于不成熟状态，低水平表达MHC、CD80、CD86等表面共刺激分子，具有较强的抗原摄取和加工处理能力，一方面可以激活T细胞诱导Th1和Th2的分化，另一方面，DCs还可以诱导Treg（regulatory T cell，Treg）的分化从而诱导免疫耐受，维持免疫系统的稳态。表皮中的DCs称为朗格汉斯细胞（langerhans cells，LCs），LCs通过广泛延伸的树突组成了连续的细胞网络，监视表皮接触的外来抗原，是针对外界环境的最前沿免疫屏障。LCs可以有效摄取病毒等病原微生物，将其呈递给T细胞，在诱导有效的免疫应答以清除病原体的过程中具有重要作用。而最近研究发现，LCs在接触体表抗原后还可以诱导免疫耐受，将免疫反应控制在一定范围之内，可以避免接触过敏性皮炎等的发生。　　在以往的工作基础上，本研究利用完整皮肤外用抗原模型，观察了完整皮肤外用抗原对皮下免疫模型的影响，并在皮肤外用抗原后分析了小鼠局部和系统体液免疫和细胞免疫应答、局部淋巴结树突状细胞的改变、调节性T细胞的变化等，初步探讨了经皮肤诱导免疫耐受的机制。具体研究内容和结果如下：　　一、完整皮肤外用抗原对之后皮下免疫模型的影响　　正常Balb/c小鼠背部剃毛约2cm×3cm大小，次日剃毛区域均匀外用溶于50μlH2O的0μg、10μg、100μg和1000μg卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)，每周一次，连续5周。第6周开始皮下注射OVA，每周一次，共3周。最后一次皮下注射后1周，小鼠尾静脉取血，采用间接ELISA法测定IgG1、IgG2a、IgM、IgE。结果显示皮下免疫3次后，外用0μg、10μg、100μgOVA小鼠血清中有高滴度的抗OVAIgG1和IgE抗体，并呈剂量依赖性下降，而1000μgOVA抗原皮肤外用组的小鼠血清OVA特异性IgG1和IgE抗体水平显著低于其他剂量的外用组（P<0.05），IgG2a在各组间无明显差异。将小鼠颈椎脱臼处死后，体外培养脾脏细胞，给予OVA刺激后，检测T细胞分泌细胞因子的情况。结果显示，1000μg组分泌的IL-2，IL-4，IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-10水平均显著低于0μg，10μg和100μg抗原外用组。（P<0.05）这提示皮肤外用高浓度抗原可以有效抑制皮下免疫所诱导的体液免疫和细胞免疫。　　二、经皮诱导免疫耐受机制的初步研究　　正常Balb/c小鼠背部剃毛约2cm×3cm大小，次日剃毛区域均匀外用溶于50μlH2O的0μg、10μg、100μg和1000μg卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)，1次/周，连用5周后，小鼠尾静脉取血，结果显示实验组均检测到较低水平的OVA特异性血清IgG1、IgG2a、IgE水平，各组间未见明显差异。取小鼠给药部位皮肤，做组织病理切片显示，表皮和真皮未见明显炎症细胞，为大致正常皮肤。这说明完整皮肤外用OVA不能引起局部的炎症反应，是皮肤诱导耐受的重要前提。　　细胞因子分析：将外用OVA5周后的小鼠，取其局部引流淋巴结和脾脏细胞培养5天，采用BD公司CBATh1Th2Th17试剂盒检测T细胞分泌细胞因子水平，结果显示，各实验组其培养上清中IL-2，IL-4，IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-10水平在各组间均未见明显差异，与正常阴性对照也无统计学差异。这表明，完整的皮肤外用OVA后不能诱导机体的细胞免疫反应。　　DCs的表型分析：用流式细胞仪分析了树突状细胞的数目、比例。结果显示随着外用抗原浓度的增加，局部引流淋巴结中CD11c+的细胞比例依次降低，而DC的表面分子MHCII、CD80、CD86的表达水平在1000μg组明显的低于外用H2O组（P<0.05），这提示高剂量抗原作用于正常无损皮肤能够诱导DC数目的减少，使DC的表型改变，抑制了DC的成熟，从而不能有效地活化T细胞产生免疫应答。　　外用OVA后Treg的表达水平升高：在Balb/c小鼠背部皮肤外用不同浓度OVA，1次/周，连用5周后，取小鼠局部引流淋巴结，研磨，离心后，分析调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）在各组间表达水平的差异。而对CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的分析显示，随着外用抗原剂量的依次增加，Treg的比例逐渐增加，并呈现剂量依赖效应。这提示外用OVA后，诱导了局部引流淋巴结调节性T细胞的产生，从而发挥了抑制效应，诱导免疫耐受。　　结论：　　本研究首次揭示了完整无损皮肤外用抗原可以产生免疫耐受效应；其机制可能与皮肤大剂量外用抗原抑制了DC表型的成熟以及诱导调节性T细胞的产生相关。