论文部分内容阅读
尽管大口径血管移植物已经可应用于临床治疗,但理想的小口径血管移植物仍需进一步研究。小口径血管由于其流速慢、剪切力低等原因易形成血栓,同时手术吻合部位易发生内膜增生,造成手术失败。本文的研究工作主要围绕对聚己内酯(Poly(ε-caprolactone),PCL)电纺丝材料的修饰改性展开,分为三个部分:
(1)通过卵磷脂与PCL混纺的方法对材料进行修饰,改善材料的亲水性、生物相容性和细胞相容性。
(2)通过真菌中表达纯化的Ⅱ型疏水蛋白HFBI对PCL电纺丝材料表面进行涂层处理,改善PCL的亲水性。进而利用疏水蛋白与抗体的蛋白间相互作用对抗体进行固定,利用抗体与人脐静脉内皮细胞表面受体的结合能力提高内皮细胞在材料上特异性黏附。
(3)通过乙二胺氨解材料,使PCL产生氨基。利用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)的吗啉乙磺酸( MES)缓冲体系,将肝素共价结合到氨基化的PCL材料上,然后通过肝素与生长因子的结合域固定血管内皮细胞生长因子(VEGF)。进而利用VEGF与内皮细胞表面的VEGF受体的特异性结合促进支架材料的快速内皮化,同时利用肝素(Heparin,Hep)的抗凝血功能改善材料的血液相容性。
本研究利用多种实验方法对材料进行了评价。采用扫描电镜(SEM)观察材料微观结构的变化;采用激光共聚焦来观察材料对抗CD31抗体和VEGF的结合能力;采用细胞黏附实验和细胞增殖实验来评价材料的细胞相容性;使用动静脉分流实验来评价材料的血液相容性;采用大鼠皮下埋植实验观察材料的炎症反应等。
实验结果如下:
(1)卵磷脂复合的电纺丝PCL材料的亲水性得到了极大的改善,纯PCL材料的静态水接触角为94.5±1.5度,而水滴可在加入卵磷脂混纺后的材料表面完全铺展并在30秒内被材料完全吸收。混纺材料的细胞亲和性显著高于纯PCL材料,可促进骨髓间充质干细胞(MSCs)在材料表面的增殖。混纺材料的红细胞溶血率显著低于纯PCL材料,表现出良好的血液相容性。
(2)疏水蛋白HFBI修饰的PCL材料的静态水接触角为60.9±0.8度,显著低于PCL对照组的104.2±1.5度,证明了疏水蛋白自组装膜结构对PCL材料亲水性的改善。修饰后的HFBI-PCL材料能高效结合抗CD31抗体,促进内皮细胞在材料上的特异性黏附。
(3)SEM观察及力学拉伸实验表明,化学处理没有对材料的纳米纤维结构及其力学强度产生显著影响。通过激光共聚焦观察到VEGF较好地分布在纤维表面。活化部分凝血活酶时间实验(APTT)表明带有肝素的材料凝血时间显著增长,凝血时间从20.87±0.73s增加到84.6±2.23s,但结合VEGF后凝血时间又下降到45.45±1.03s。说明部分肝素被结合的VEGF屏蔽。动静脉分流实验( AV-shunt)表明,带有肝素的材料有较好的抗凝血效果。体外细胞实验表明,材料表面固定的VEGF可促进入脐静脉内皮细胞(HUVEC)的黏附和增殖,体内实验观察到结合了VEGF的材料可促进移植物周围组织的微血管新生。
结论:通过对PCL材料三种不同方法的修饰尝试构建一种较为理想的小口径人工血管支架,VEGF-HP-PCL材料不仅可以保持VEGF生长因子在体内较长时间的生物学活性,还可以保留肝素的抗凝血性能。用这一方法构建的血管材料在移植术后可持续抗凝,并可在体内诱导支架材料快速内皮化,具有良好的应用前景。