进入21世纪以来,不孕不育患者数量呈现逐年递增的趋势。资料显示,不孕不育症已经成为继心脑血管疾病、肿瘤之后威胁人类健康的第三大疾病。全世界大概有15%左右的育龄夫妇遭受着不孕不育的困扰,我国的发病率也居高不下,约为12.5%。不孕不育与很多因素有关,其中男性因素约占据一半。造成男性不育的病因包括如环境污染、电离辐射、先天发育异常、染色体异常等。虽然近年来,随着分子生物学、遗传学和辅助生殖技术的发展与应用,一部分男性不育症患者得到了很好的治疗,但由于导致不育的原因复杂,男性不育或生育能力低下的状况并没有从根本上得到改善,原因在于我们对这一过程的发病机理不透彻。因此,阐明男性不育的分子机制,可以促进男性不育症临床诊断技术的发展,为临床治疗提供新思路。lncRNA(long non-coding RNAs,lncRNA)是一类转录本长度200nt的非编码RNA。lncRNA以DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等作用方式,调节基因表达水平,参与细胞分化、发育、增殖、凋亡等多种生物学过程。大量研究表明,lncRNA的表达异常将会引起肿瘤、心血管疾病和生殖系统疾病的发生。人类lncRNA Gas5(growth arrest-specific transcript 5)位于染色体1q25.1,全长约为650nt。根据文献报道,以往针对Gas5的研究主要集中于肿瘤领域,认为Gas5起着抑癌基因的作用。最新研究显示,Gas5可以促进胚胎干细胞的自我更新,参与平滑肌细胞和雌性生殖干细胞的增殖,调节胰岛素的合成和分泌来维持β细胞的功能。目前关于Gas5在雄性生殖中的作用尚未有研究报道。由于睾丸间质细胞(Leydig细胞)发育异常、功能受损导致精子生成障碍是引起男性不育的重要原因,因此,本研究对Gas5在睾丸中表达进行定位分析,并探索其在睾丸Leydig细胞中的可能生物学活性。目的我们在前期研究发现,在生精功能低下状态下,Gas5表达异常。本研究拟探索Gas5在睾丸中表达定位,并以睾丸Leydig细胞为研究对象,研究Gas5对TM3 Leydig细胞生物学功能的影响及潜在可能的机制,为男性不育的诊断和治疗提供新的研究线索和实验依据。方法利用smiFISH方法对Gas5在睾丸组织和TM3 Leydig细胞中的定位进行检测;构建干扰和过表达Gas5慢病毒,转染TM3细胞并筛选;为了解Gas5对TM3增殖的影响采用EdU和MTT实验进行检测,同时用FCM(Flow cytometry)法观察Gas5过表达和干扰TM3后,细胞凋亡和周期的变化;为了进一步分析可能存在的分子机制,采用蛋白质质谱技术筛选干扰组差异表达蛋白,并对差异蛋白进行GO及STRING分析;利用免疫荧光检测Gas5过表达和干扰后,Leydig细胞核仁损伤情况;RT-qPCR检测TM3 Leydig rRNA表达变化;RNA与蛋白质互作网站预测Gas5可能结合的蛋白,并用RIP实验进行验证。结果1.smiFISH定位结果显示Gas5表达于睾丸生精细胞、Sertoli细胞与Leydig细胞;在Leydig细胞的细胞质和细胞核中均有分布。2.成功构建Gas5过表达与干扰慢病毒,转染TM3细胞经筛选形成稳定的Gas5过表达和敲低细胞株。3.MTT及EdU结果显示,Gas5过表达会促进TM3细胞的增殖,Gas5敲低会抑制TM3细胞的增殖(P<0.05)。4.FCM结果显示,Gas5过表达减少了G1期细胞的百分比,同时增加了S期细胞的数量;在干扰组,Gas5表达下调导致TM3细胞G2期阻滞(P<0.05)。凋亡分析检测结果显示各组间无明显差异。5.TripleTOF5600检测结果显示,Gas5敲低影响核糖体的生物发生。6.免疫荧光结果显示,Gas5过表达组核仁面积增加;Gas5干扰组核仁面积减少;7.RT-qPCR结果显示,Gas5下调后rRNA表达量减少,而Gas5过表达后rRNA表达量增加。结果表明Gas5下调后核糖体合成功能受损。8.RNA与蛋白互作网站预测Gas5可能结合核仁蛋白NCL(nucleolin),RIP结果证明Gas5可通过结合NCL来调控细胞核糖体的发生从而影响细胞增殖。结论:1.Gas5在Leydig细胞中表达,Gas5可促进睾丸Leydig细胞的增殖。2.Gas5对Leydig细胞的促进增殖作用,可能通过结合NCL调控核糖体生物发生而实现。