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肾细胞癌是常见的肾脏肿瘤，占肾脏肿瘤的第三位，其发病率逐年增高，且有易发于老年，男性较女性更为常见。肾细胞癌治疗主要依赖手术及腹腔镜等手段，故大多数患者常被术后并发症以及放化疗的副作用所困扰，大大降低了生活质量。因此寻找特异的治疗靶点及治疗手段十分重要。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）做为TNF家族成员，能够诱导肾细胞癌肿瘤细胞凋亡。本研究的目的在于通过miRNA反应元件MRE，调控TRAIL在癌症细胞组织与正常细胞组织中的表达，从而选择性杀伤肿瘤细胞，对正常组织器官不产生细胞毒性。具体研究如下：1实验路线1.1miR-138, miR-199在肾癌细胞系、组织中与正常细胞系、组织中的表达。1.1.1HK-2人正常肾上皮细胞系，ACHN和786-O细胞系和L-02人正常肝细胞培养。1.1.2通过实时定量PCR比较RCC细胞系和正常细胞系miR-138和miR-199表达水平的差异。1.1.3收集患者的肾癌和正常肾组织新鲜组织。1.1.4通过实时定量PCR检测比较肾细胞癌组织和正常肾组织中miR-138，miR-199表达水平的差异。1.2在miR-138，miR-199的MRE的控制下，RCC细胞外源基因的表达。1.2.1通过将这些的MRE的两个拷贝到荧光素酶的载体编码区的下游部位，产生psiCheck2-3MREs。1.2.2psiCheck2和psiCheck2-3MREs的转染HK-2，L-02，ACHN和786-O细胞，48小时后确定用双荧光素酶报告系统确定其荧光素酶活性。1.3TRAIL在RCC细胞内的腺病毒载体下miR-138，miR-199的MRE的调节介导的表达。1.3.1将miR-138，miR-199的MRE的两个拷贝放入开放阅读框后面的生成AD-TRAIL-3MREs。1.3.2免疫印迹比较Ad-TRAIL，AD-TRAIL-3MREs与Ad-EGFP转染后，在L-02和ACHN上TRAIL表达的差异。1.3.3实时定量PCR比较Ad-TRAIL，AD-TRAIL-3MREs与Ad-EGFP转染后，在L-02肝细胞和ACHN上TRAIL表达的差异。1.4miR-138, miR-199在细胞内调控腺病毒载体，进而影响TRAIL在RCC细胞中的表达。1.4.1通过免疫印迹和实时定量PCR比较转染miR-138，miR-199和抑制剂L-02之间TRAIL表达水平差异。1.4.2通过免疫印迹和实时定量PCR比较转染miR-138，miR-199和抑制剂ACHN之间TRAIL表达水平差异。1.5western blot和G0/G1细胞比值检测比较由Ad-TRAIL-3MREs诱导ACHN细胞和L-02细胞的凋亡。1.6MTT检测在各种重组腺病毒感染下，各种RCC细胞和正常细胞的活性。1.7在各种重组腺病毒感染下，检测动物体内ACHN诱发的RCC肿瘤生长情况，在RCC肿瘤组织中TRAIL和凋亡转导通路的表达1.8调查TRAIL诱导的肝细胞毒性。1.8.1从无肿瘤但给予PBS和重组腺病毒小鼠身上获取血液和血清。1.8.2ELISA检测血ALT水平1.8.3western blot检测给予重组腺病毒后肝组织TRAIL和凋亡转导通路的表达。2结果2.1评价RCC和正常细胞miR-138，miR-199的表达水平。与正常对照组比较，RCC组织和RCC细胞系中，miR-138，miR-199被认为是低表达。在正常肾细胞HEK-293和肝细胞L-02中，miR-138，miR-199过表达。2.2miR-138，miR-199的MRE限制正常细胞内外源基因的表达。与psiCheck2转染组相比，转染psiCheck2-3MREs组的HEK-293和L-02细胞的荧光素酶表达水平被大大地抑制。然而，转染psiCheck2和psiCheck2-3MREs RCC细胞系之间的荧光素酶活性没有显著差异。2.3L-02和ACHN细胞转染Ad-TRAIL, Ad-TRAIL-3MREs和Ad-EGFP后，检测TRAIL蛋白的表达。AD-TRAIL转染的L-02和ACHN细胞表达的TRAIL能力没有差别。与此相反，在Ad-TRAIL-3MREs感染的L-02细胞，TRAIL的表达被大大地抑制，但在ACHN细胞TRAIL表达则无影响。 qPCR实验进一步证实，TRAIL的mRNA可以在Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-3MREs感染的ACHN细胞以及Ad-TRAIL感染L-02细胞很容易地检测到。但在转染Ad-TRAIL-3MREs正常肝细胞无TRAIL mRNA表达。2.4由于miR-138，miR-199在细胞内调节， Ad-TRAIL-3MREs转染的RCC细胞系中选择性表达TRAIL。免疫印迹和qPCR实验表明，转染miR-138，miR-199抑制剂L-02细胞部分恢复TRAIL的表达。由于转染了miRNA相似物，增加了miR-138，miR-199的水平，ACHN肾癌细胞表达TRAIL适度降低。2.5MRE调控腺病毒载体选择性表达TRAIL导致肾癌细胞的选择性凋亡。在Ad-TRAIL感染L-02细胞和Ad-TRAIL或Ad-TRAIL-3MREs转染ACHN细胞上裂解的Caspase3和PARP蛋白的高表达。Ad-TRAIL-3MREs转染的L-02转导的细胞Caspase3和PARP没有改变。Ad-TRAIL感染L-02细胞和用Ad-TRAIL或Ad-TRAIL-3MREs转染的ACHN细胞中sub-G0/G1细胞的比值增加。然而，Ad-TRAIL-3MREs转染的L-02细胞sub-G0/G1的比例是相当低的。2.6Ad-TRAIL-3MREs能够诱导RCC细胞的细胞毒性而不损伤正常细胞。这些数据表明，AD-TRAIL在降低癌细胞和正常细胞的生存没有任何歧视。与此相反，AD-TRAIL-3MREs在诱导RCC细胞毒性时有一个高选择性。2.7在体内生长的RCC可以通过AD-TRAIL-3MREs治疗来抑制。用Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-3MREs治疗的小鼠中，极大地抑制ACHN异种移植的肿瘤。TRAIL表达的免疫印迹分析表明，注射Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-3MREs肿瘤之间TRAIL的表达无显著差异。另外，在两组肿瘤中检测出caspase3和PARP的裂解。2.8Ad-TRAIL-3RMEs能够保护肝脏避免TRAIL诱导的凋亡。用Ad-TRAIL治疗的小鼠ALT水平显著提高。与用Ad-EGFP和PBS对照相比，用Ad-TRAIL-3MREs治疗的小鼠血清ALT水平没有发生变化。此外，TRAIL与细胞凋亡相关蛋白的免疫印迹分析表明，AD-TRAIL激活肝组织凋亡途径，而AD-TRAIL-3MREs没有影响肝细胞的状态。3结论3.1在RCC细胞和组织与正常的人相比较miR-138，miR-199的水平降低。3.2miR-138，miR-199的MRE可以有效地抑制在正常细胞外源基因的表达。3.3miR-138，miR-199的MRE可以用于限制在RCC细胞腺病毒介导的TRAIL的表达。3.4miR-138，miR-199的水平控制腺病毒载体介导的TRAIL选择性表达。3.5TRAIL选择性表达能够诱导RCC特异性凋亡。3.6MRE调节的腺病毒是对正常细胞无细胞毒性的，有针对性的抗肿瘤剂。3.7Ad-TRAIL-3MREs能够经由TRAIL诱导的细胞凋亡抑制的RCC肿瘤在小鼠中的生长。3.8MRE调控TRAIL表达避免了TRAIL诱导的肝毒性。