瓜类蚜传黄化病毒的检测和侵染性克隆构建

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瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borneyellows virus,CABYV)属于黄症病毒科(Luteoviridae),马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)。该病毒在欧洲和亚洲的主要瓜类种植区均有报道发生,流行范围广,大面积发生时造成严重的减产。目前CABYV已在我国多个省市发生,对西甜瓜等重要经济作物的安全生产造成极大的威胁。  为了了解该病毒在我国的发生情况,我们对新疆鄯善、甘肃瓜洲和河南通许地区的瓜类作物进行了取样调查。采用双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)法对常见的病毒进行病毒检测,以期了解这三个地区的西瓜甜瓜病毒种类及分布,为当地西瓜和甜瓜病毒病的防控提供参考。结果表明:小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellow mosaic virus,ZYMV)的检出率最高,为31.3%,其次为瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borneyellows virus,CABYV)和西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV),检出率分别为26.9%、26.1%,黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus,CMV)和甜瓜蚜传黄化病毒(Melon aphid-borneyellows virus,MABYV)的检出率较低,分别为14.2%、8.2%,而南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)和番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ring spot virus-watermelon strain,PRSV-W)未检出,河南和新疆发现MABYV尚属首次。  经过RT-PCR检测,发现这3个瓜类产区均有CABYV发生。通过扩增CABYV基因组的部分片段,我们获得了1.4kb的序列,包括3端的部分依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因、非编码区(NCR)和全长外壳蛋白(CP)基因。通过对序列进行分析,发现分离物的CP基因与GenBank中的序列进行比对,其序列相似性为93.2%-100%。通许分离物间序列相似性为97.6%-99.9%,瓜州分离物间序列相似性为97.4%-100%,鄯善分离物间序列相似性为97.9%-100%,组内表现出极高的同源性;基于其部分RdRp基因、NCR及CP基因序列构建的系统进化树表明:25个CABYV分离物与中国及周边地区(泰国、韩国等)的分离物聚为一簇,而与欧洲地区分离物距离较远,说明了该病毒分子变异与分离物的地理分布有关。  同时,在前期工作中,我们通过设计引物克隆全长CP基因,并插入原核表达载体BL21(DE3),但在IPTG诱导下,无法表达蛋白。通过对CP基因进行分析,优化了5端序列,将抑制原核表达的位点进行突变,重新合成5端280bp的序列,将此优化后的序列替换掉之前的序列,得到优化后的重组质粒。使用1mmol/L的IPTG37℃诱导4h,能得到40k Da大小的蛋白,与预期一致。  侵染性克隆是病毒基因功能及其他研究的基础。通过RT-PCR将CABYV全长基因组分为2段进行扩增,然后利用无缝克隆技术(In-Fusion)插入双元表达载体pXT1,转入农杆菌GV3101,构建农杆菌介导的侵染性克隆。浸润接种本生烟28天后通过RT-PCR及Northern-Blot能在系统叶中检测到CABYV基因组及亚基因组,接种40天能观察到典型的黄化症状,与CABYV的田间症状相似,表明其已具备对本生烟的侵染活性。
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